重组牛分枝杆菌CFP-10蛋白间接ELISA检测方法的建立-论文.pdf

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1、南方农业学报JournalofSouthernAgricuhure2014，45(7)：1291—1295ISSN2095—1191；CODENNNXAABhttp：／／www．nfnyxb．cnDOI：10．3969／j：issn．2095-1191．2014．7．1291重组牛分枝杆菌CFP一10蛋白问接ELISA检测方法的建立谢志勤，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，范晴，罗思思，牟群z，莫文胜。(广西兽医研究所／广西畜禽疫苗新技术重点实验室，南宁530001；。桂林市动物疫病预防诊断中心，广西桂林541001永福县动物疫病预防诊断中心，广西桂

2、林541800)摘要：【目的】建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA方法，快速区分致病性与非致病性牛分枝杆菌，为净化牛结核病提供技术支撑。【方法】以体外扩增表达并纯化的重组牛分枝杆菌CFP．10蛋白为包被抗原，建立检测牛分枝杆菌的间接ELISA，并应用方阵法优化间接ELISA的检测条件。【结果】重组CFP．10蛋白间接ELISA的最佳检测条件为：以8txg／mL重组CFP一10蛋白包为被抗原，37qC下包被1h，再以5％脱脂奶封闭1h，血清(一抗)经1：200倍稀释后作用1h，然后以1：500倍稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗免IgG(~)作用1h。该间接ELIS

3、A的阴阳临界值为0．281，仅与牛分枝杆菌呈阳性反应，与牛布鲁氏杆菌、牛口蹄疫病毒无交叉反应；其敏感性能检测1：320倍稀释的血清，批内与批间的变异系数均小于5．0％。【结论】建立的重组牛分枝杆菌CFP一10蛋白间接ELISA具有特异、敏感等优点，临床上可用于致病性牛分枝杆菌的检测。关键词：牛分枝杆菌；CFP一10蛋白；间接ELISA；阴阳临界值中图分类号：$854．43文献标志码：A文章编号：2095—1191(2014)07—1291—05DevelopmentofanindirectELISAusingtherecombinantculturefil

4、terprotein10fromMycobacteriumbovisXIEZhi—qin，XIEZhi—xlln，LIUJia—bo，PANGYao—shan，DENGXian-wen，XIELi—ji，FANQing，LUOSi—si，MOUQ．n，MOWen-sheng(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccineandNewTechnology，Nanning530001China；GuilinAnimalDiseaseDiagnosticCenter，G

5、uilin，Guangxi541001，China；YongfuAnimalDiseaseDiagnosticCenter，Yongfu，Guangxi541800，China)Abstract：【Objective】Anindirectenzyme—linkedimmunosorbentassay【ELISA)withtherecombinantculturefilterprotein10(CFP一10)fromMycobacteriumbovis(M．bovis)wasdevelopedtodetectM．borisasarapidandsensiti

6、vemethod．【Method】rrheCFP—10genefromM．boriswasamplifiedandtransferredtocompetentcel1．eexpressedCFP一10geneproteinfromrecombinantwaspurifiedandusedasthecoatingantigeninthisELISA．Thebestcondi—tionsforthisELISAweretestedwithCFP一10recombinantproteinasanantigen．【Result】Thebestcoatingeonc

7、entra—tion0ftheCFP一10proteinwas8b~g／mLat37℃forlhanditwasenclosedwith5％skimmedmilkfor1h．Thebestantibody(serum)wasdilutedto200andthegoat—rabbitantibodyIgGlabeledwithenzymeHRPwasdilutedto500beforeincubatedat37oCfor1h．Thecriticalvaluewas0．281．Itdidnotcrosswiththeserumfrombrucellosis，f

8、ootandmouthdisease．anditwasonlypo