基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立.pdf

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1、河南农业科学，2013，42(8)：119-123JournalofHenanAgricuhuralSciences基于S蛋白检测猪流行性腹泻抗体间接ELISA方法的建立邓祖丽颖(郑州幼儿师范高等专科学校，河南郑州450000)摘要：为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白抗体的间接ELISA方法，应用RT—PCR方法扩增PEDV河南流行毒株S基因794bp片段，将其克隆至原核表达栽体pET一32a(+)，构建pET一32a—S重组质粒并转化至宿主菌BL21，在37℃条件下加入IPTG进行诱导表达，经SDS—PAGE分析显示，该蛋白以融合蛋白形式

2、高效表达，分子量约为46．9kD；Western—blot分析表明，所表达的重组蛋白具有良好的反应原性。以纯化的S蛋白为包被抗原建立检测PED抗体的间接ELISA方法，试验确定抗原最佳包被量为0．04ug／~L，血清最佳稀释度为1：1OO，HRP—IgG二抗最佳稀释度为1：2000，阳性判定标准为OD。值≥0．24。应用该方法对采自河南省不同地区23个养猪场的279份血清样本进行检测，结果显示，母猪血清样本PED抗体阳性率为97．42(227／233)；育肥和保育猪血清样本阳性率为71．74(33／46)。试验结果表明，所建立的间接ELISA方法特异

3、性、灵敏性和可重复性良好，可以用于猪群PED抗体水平监测和流行病学调查。关键词：猪流行性腹泻病毒；S蛋白；原核表达；酶联免疫吸附试验中图分类号：$858．28文献标志码：A文章编号：1004—3268(2013)08—0119—05ProkaryoticExpressionofPEDVSProteinandDevelopmentofIndirectELISAforDetectionofItsAntibodyDENGZULi—ying(ZhengzhouInfantNormalSchool，Zhengzhou450000，China)Abstract：

4、Aspike(S)protein—basedELISAwasdevelopedtodetecttheantibodiesagainstporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)．The794pfragmentofSgenefromPEDVHenanisolatewasamplifiedbyRT—PCRandinsertedintotheexpressionvectorpET_32a(+)．TherecombinantplasmidwasnamedaspET-32a—S．Afusionproteinwasexpressedin

5、BL21thattransfectedbypET一32a—SandinducedbyIPTG．Themolecularweightoftherecombinantproteinwasabout46．9kDanalyzedbySDS—PAGE，andtheimmunoreactionactivityoftherecombinantproteinwasconfirmedbyWestern—blot，inwhichpositiveserumagainstPEDVwasused．AnindirectELISAfordetectingantibodiesaga

6、instPEDVwasdevelopedbyusingexpressedSproteinascoatinganti—gen．TheresultsshowedthattheoptimalcoatingconcentrationforSproteinwas0．04rig／well，theserumdilutionwas1：100，andtheHRP—IgGdilutionfoldwas1：2000．Thepositivecriteri—onforthisELISAassaywasOD45o≥0．24．Foratotalof279fieldsamplest

7、ested，thepositiveratesofSOWserum，nurseryandfatteningpigserumwere97．42(227／233)and71．74(33／46)，respectively．TheresultsindicatethatthisassayiSspecific，sensitiveandreproducible，whichmightbesuitablefordetectinganti—PEDVantibody．Keywords：PEDV；Sprotein；prokaryoticexpression；ELISA收稿日期

8、：2013—02—28作者简介：邓祖丽颖(196f一)，女，河南郑州人，高级讲师，硕士，主要从事生物技术教学