基于趋磁细菌磁小体的新型主动靶向线粒体的MR双功能探针制备-论文.pdf

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1、主堡堂盎年6月第48卷第6期ChinJRadiol，June2014，Vo1．48，No．6·509·．短篇论著．基于趋磁细菌磁小体的新型主动靶向线粒体的MR双功能探针制备张薇薇许乙凯刘瑞源1975年Blakemore⋯在美国盐泽泥浆中发现一类特殊绿色荧光探针(Mito—trackergreen)购自江苏碧云天生物技术细菌，其特征为体内含有沿细菌长轴方向排列的磁小体研究所；细胞核染料Hoechst33342购自美国Invitrogen公司。(bacterialmagneticparticles，BMPs

2、或称magnetosomes)，后者2．主要仪器及设备：AvantiJ-26XP大容量离心机(美国本质为具有天然脂性包膜的纳米Fe0磁性颗粒。由于磁BeckmanCouher公司)、磁力架(13本东洋纺公司)、H一7650小体具有尺寸及形状均一、高结晶度、更持久的．r，缩短效应(120kV)电子显微镜(日本HITACHI公司)、EQUINOX55及具有天然的脂性膜结构包裹等优点，其作为一种高效的傅里叶变换红外光谱一红外显微镜联用仪、D8ADVANCEXMR对比剂可以用于分子水平靶向定位。细胞色素C线衍射

3、物相分析仪(德国Bruker公司)、PPMS综合物性测量(CytochromeC，CytC)是位于线粒体内膜外侧的、具有调控细系统EverCool(美国QUANTUMDESIGN)、BI．200SM动静态胞能量代谢和凋亡的双重功能的水解蛋白，近年来引起广泛激光散射仪(BrookenHaven公司)、3K30高速冷冻离心机关注_]J。以FeO纳米颗粒作为MRI对比剂进行靶向修饰(美国Sigma公司)、Analytst800原子吸收光谱仪(美国是近年来分子影像学研究的热点之一，目前该领域多以人工Perkin

4、Elmer公司)、VC一505超声波细胞破碎机(美国SONIC合成FeO纳米颗粒为主要研究对象，如超顺磁性氧化铁公司)、Zetasizernano—ZS90马尔文纳米粒度及Zeta电位分析(superparamagneticironoxid，SPIO)[4J、超小型超顺磁性氧化仪(英国马尔文公司)。铁(uhrasmallsuperparamagneticironoxide，USPIO)等。但3．实验方法：(1)趋磁细菌AMB一1培养。采用二级种鲜有作者将上述生物源性FeO纳米颗粒应用于MR对比子培养和扩

5、大培养方式J。(2)提取、纯化磁小体。(3)剂研究。磁小体理化性能表征分析。首先通过透射电子显微镜笔者在2012年8月至2013年2月以南方医院临床实(TEM)分别观察活体趋磁细菌内的磁小体及纯化后的磁小验研究中心培养的趋磁细菌AMB一1及其磁小体为研究对体的排列状态、粒径大小及膜的厚度；再使用X射线衍射象，制备了具有主动靶向结合线粒体细胞色素C的新型双功(XRD)仪、能谱仪(EDS)、傅里叶红外变换光谱(FTr—IR)、磁能MR探针，并经过一系列的理化性能表征、水质子弛豫效滞回线(hysteresis

6、loop)及zeta电位检测分别对磁小体各组率的测定、体外靶向实验及MRI成像检测，现报道如下。成成分的存在状态、各元素种类与含量、膜表面存在的化学一基团、磁学特征及磁小体溶液分散体系的稳定性进行检测；、资料与方法1．实验材料：(1)菌株及培养基：趋磁细菌AMB一1，美国最后使用电感耦合等离子体质谱(ICP—MS)测定磁小体溶液模式培养物集存库(Americantypeculturecollection，ATCC)中Fe“浓度并用于后续实验。(4)CytC配体的制备。参考序号700274，由华侨大学刘源

7、岗教授惠赠。培养基按照Lau等的结果，选择寡核苷酸“5一CCGTGTCTGGGGCCGATCC配方自行配制。(2)CytC配体：由美国LifeACCGGCGCATFGGGTACGTTG"Iq'GC一3”’为CytC配体，Technologies公司合成。(3)其他试剂：澳洲胎牛血清并且根据实验需要进行了5端醛基(aldehydegroup，ALD)修(FBS)、RPMI1640培养基购自美国Coming公司；Hanks平饰和3端荧光AlexaFlour647(。／_0n=650／665)的修饰。最终得到

8、“ALD一5一CCGTGTCTGGGGCCGACC衡盐缓冲液、4一羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Gibco公司；磷酸缓冲液、二甲基亚砜、TE(s—HC1+EDTA)缓冲GGCGCATrGGGTACGTTGTI'GC-3一647”的CytC配体。(5)磁小体与CytC的连接，即cBMPs合成。(6)EDC、液、1．乙基一(3一二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、NHS交联M．PEG—COOH、cBMPs⋯，最终合成PEG—cBM