噬菌体效价的测定

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1、实验九噬菌体效价的测定目的要求1、掌握噬菌体效价测定的原理及方法2、观察噬菌斑的形态实验内容一培养基和实验物品的准备本次实验准备工作（2人/组）1、配制牛肉膏蛋白胨液体培养液（pH7.4-7.6）；（已准备好）。2、测定效价时稀释用9ml牛肉膏蛋白胨液体培养液——2支/组，分装于18×180mm试管；3、牛肉膏蛋白胨固体培养基（2%的琼脂）——底层用，150ml/组，装于250ml三角瓶，（用于制备9个无菌平板，倒薄一点）4、上层用5ml牛肉膏蛋白胨半固体培养基（0.8%的琼脂），融化后分装于15×150

2、mm试管中加塞包扎灭菌，10支/组；（上周已准备好）。5、1ml无菌吸管4支/组。实验内容二噬菌体知识介绍一、几个重要概念1、噬菌体：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，分布极广，个体很小，在光学显微镜下看不见，需用电镜观察。不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。2、噬菌斑：在混浊的细菌菌面（菌苔）上形成的透明区域，是由噬菌体不断侵染宿主细胞裂解形成的，其形状、大小不等。3、噬菌体效价：指1mL样品中所含具有侵染活性的噬菌体（烈性噬菌

3、体）数量——噬菌斑形成单位（pfu，plaque-formingunit）。效价（titre，titer）这一名词在不同的场合有其不同的含义（如抗生素等）。二、病毒粒子的构造（模型）噬菌体的形态及分类科属大肠杆菌T4噬菌体结构示意图大肠杆菌T4噬菌体结构示意图及电镜照片头部六角形基板领环螺旋形尾鞘核心或管（中空）尾刺或刺突尾丝噬菌斑示意照片宿主细菌菌苔噬菌斑大肠杆菌T噬菌斑的表型形态三、噬菌体的分类——根据噬菌体与宿主菌的相互关系烈性噬菌体（virulentphage）能在宿主细胞内复制增殖，产生许多子代

4、噬菌体，并最终裂解细菌。温和噬菌体（temperatephage）噬菌体基因与宿主染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体DNA能随细菌DNA复制，并随细菌的分裂而传代，存在游离态、整合态、营养态三种形式。针对温和噬菌体来说：前（原）噬菌体、溶源菌四、噬菌体繁殖（生活周期）1、吸附2、侵入3、增殖（生物合成）4、成熟装配5、裂解释放T4噬菌体吸附和DNA的注入T偶数噬菌体感染大肠杆菌的扫描电镜照片T4噬菌体的生活周期T4噬菌体的装配五、噬菌体的应用1、细菌的鉴定与分型噬菌体与宿主菌的关系具有高度特异性，即一

5、种噬菌体只能裂解一种和它相应的细菌，故可用于未知细菌的鉴定和分型。2、遗传学及分子生物学研究的重要工具噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，且易获得大量的突变体——构建基因文库（λ噬菌体）；基因工程载体；噬菌体展示技术。3、细菌感染的诊断与治疗利用其专一性，可以诊断和治疗一些相关细菌感染性疾病（用于治疗时，其分泌的细菌素也可以应用，临床外伤治疗已有应用）但专一性也限制了噬菌体在临床上的广泛应用（人们最需要的是广谱性）。六、噬菌体的危害在工业上会造成所培养菌体的大量裂解，使生产难以完成。表现形式：①

6、发酵周期明显延长；②碳源消耗缓慢；③发酵液变清，镜检时，有大量异常菌体出现；④发酵产物的形成缓慢或根本不形成；⑤用敏感菌作平板检查时，出现大量噬菌斑；⑥用电子显微镜观察时，可见到有无数噬菌体粒子存在。轻则延长发酵周期、影响产品的产量和质量，重则引起倒罐甚至使工厂被迫停产。七、以防为主的措施：1、决不使用可疑菌种；2、严格保持环境卫生；3、决不排放或随便丢弃活菌液；4、注意通气质量空气过滤器要保证质量并经常进行严格灭菌，空气压缩机的取风口应设在30～40米高空；5、加强管道及发酵罐的灭菌；6、不断筛选抗性菌种

7、，并经常轮换生产菌种；7、严格执行会客制度。实验内容三噬菌体效价的测定一、噬菌体效价测定的方法（梯度稀释）斑点试验法液体稀释试管法——以不长菌判断（澄清）双层平板法——最常用，优点较多单层平板法载玻片法——快速其它病毒的效价（计数）测定——空斑计数、电子显微镜直接计数、免疫学间接测定（凝集、ELISA——酶标仪）噬菌体效价测定的方法二、双层平板法单层与双层平板法所形成的噬菌斑的比较双层平板法的优点：①加了底层培养基后，可使原来底面不平的玻璃皿的缺陷得到了弥补；②所形成全部噬菌体斑都接近处于同一平面上，因此

8、不仅每一噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下噬菌斑的重叠现象；③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的噬菌斑较大，更有利于计数。三、实验原理一个噬菌体→侵染细胞→引起裂解→扩散重复裂解→形成一个噬菌斑（琼脂凝胶中）宿主细胞数远远大于噬菌体数？噬菌体效价（pfu/ml）=噬菌斑数×10×稀释倍数四、实验步骤1、制备底层平板将已灭菌融化的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板9个（倒薄一些），凝固。2、加入大肠杆菌敏感菌在每个