微生物菌种的筛选与保藏

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1、微生物学刘光磊liugl@ouc.edu.cnCollegeofMarineLifeSciences,OceanUniversityofChina第六章微生物菌种的筛选与保藏本章要点如何按目的要求筛选菌株微生物菌种保藏方法了解国内外各大菌种保藏机构种≠菌株（speci（strain）es）>第一节从自然界中分离筛选菌种生产菌株来源1、索取或购买2、自己选育(1)用原有菌株进行遗传改造进行育种①诱变育种②基因重组育种(2)向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育(3)从自然界中分离菌种从自然界中分离菌种就是从自然界微生物

2、资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。从自然界中分离筛选菌种的一般步骤筛选目标→设计方案采样增殖培养平板分离性能考察(生筛选(初筛、单株纯种分产性能试验、复筛)离菌种鉴定）一、采样从自然界种采集含目的菌的样品1.环境条件对土样本中微生物分布的影响（1）营养环境①高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌；②富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；③森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；④含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；⑤油田土：石油分解菌；（2

3、）水分①离地表5-15cm土样②含水过多、过少都不理想（3）温度：采样以秋季为好（4）通风（5）酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸2.采样方法（1）去除表层土（2）取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或逆料袋中（3）植物根、茎、叶、花、果实。3注意记录：时间，地点，环境情况等样品袋应封好口，防止水分失去土样应在分离前破碎尽快分离红树林二.增殖培养（富集培养）适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的

4、菌的生长受到抑制4.方法（1）控制营养成分①纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌②可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种③酒精废水，可以增殖废水利用菌*多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2）控制培养基pH细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸但非目的菌的生长不能被完全抑制（3）控制培养温度30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株（4）热处理——增殖芽孢细菌样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌（5）添加抑制剂10%酚数滴：

5、抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制毒菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌三.纯种分离目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养1、纯种分离的一般方法（1）稀释平板法倾注平板或涂布平板（2）划线法稀释分离涂布平板划线分离（3）组织培养法适用于分离高等真菌及植物病原菌高等真菌：如香菇→切1小块菌盖→10%漂白粉消毒处理→无菌水冲洗→臵琼脂平板上→培养→长出菌丝体或：→悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内→培养→长出菌丝体注意：对蔓延性霉菌：

6、①加1%去氧胆酸钠②察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖2、平皿反应快速检出法——定性或半定量（1）纸片培养显色法滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基用接种环接种保湿恒温培养据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量（2）透明圈法根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸钙平板透明圈：产酸酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶（3）变色圈法淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支链淀粉平板喷稀碘液：蓝色圈：异淀粉酶无色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶木聚糖平板加刚果红：木聚

7、糖酶（4）生长圈法工具菌：营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物菌落形态明显不同于目的菌方法：106~107工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育（5）抑制圈适用：抗生素产生菌的选育工具菌：对目的抗生素敏感的微生物例：目的菌为产生抗G+细菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黄色葡萄球菌方法目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落代谢物积累：用打孔器（6CM）将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗

8、生素积累于小琼脂块中测定：取107工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低刚