新生大鼠海马脑片培养方法

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1、中国药理学与毒理学杂志２００５年２月；１９（１）：７０－７４·７０·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５Ｆｅｂ；１９（１）：７０－７４新生大鼠海马脑片培养方法王勇２，朱小南１，陈汝筑１，何进１，余剑平１，汪雪兰１（１．中山大学中山医学院药理学教研室，广东广州５１００８９；２．南方医科大学珠江医院临床药理基地，广东广州５１０２８２）摘要：目的建立新生大鼠海马脑片体外长期培养了理想的条件。由于体外培养脑片突出的优越性，方法。方法取出生后１０ｄ的新生大鼠海马，切成因此脑片培养技术十分重要。随着脑片培养技术的３００μｍ厚的脑片，转至

2、带有微孔膜插件的培养皿中不断改进，目前国外不仅建立了新生鼠海马脑片培进行培养。培养期间进行形态学观察，并通过ＭＴＴ养技术，而且还探讨了成年鼠海马脑片的培养技法鉴定组织活力，免疫组化法观察胶质细胞对损伤术［６］。但在培养海马脑片长期成活的基础上，系统的反应，电生理反应以检测神经细胞功能。结果地观察培养海马脑片的生理功能尤其是神经冲动传培养海马脑片逐渐变薄，５ｄ后结构清晰，细胞形态输的研究报道目前还不多。本研究采用微孔膜插件完整；ＭＴＴ法显示培养４０ｄ内的海马组织均能保持培养海马脑片，并通过多种方法鉴定培养海马脑片高摄入ＭＴＴ能力；在Ｓｃｈａｆ

3、ｆｅｒ侧枝给予单脉冲刺激，的存活和功能。于ＣＡ１区能接收到完整的群峰电位；谷氨酸导致胶质细胞抗胶质纤维酸性蛋白高表达。结论本方法１材料与方法培养４０ｄ的海马脑片具有正常的活力和功能。关键词：海马；海马脑片，培养的；模型，动物１．１动物、试剂与仪器新生１０ｄ的Ｗｉｓｔａｒ乳大鼠由中山大学实验动物中图分类号：Ｒ９６５．２中心提供，ＭＥＭ培养基、马血清购于ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司，文献标识码：Ａ膜插件（ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｓｅｒｔ）为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品；噻唑蓝文章编号：１０００３００２（２００５）０１００７００５（ＭＴＴ）、抗胶质纤维

4、酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗体、焦油紫均购于Ｓｉｇｍａ公司。对神经系统许多功能的研究，最理想的条件是体视显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＳＺＸＩＬＬＢ２００）、振动切片保持在体固有的、立体的神经细胞之间及神经细胞机（ＭＡ７５２ｍｏｔｏｒｉｓｅｄａｄｖａｎｃｅｖｉｂｒｏｓｌｉｃｅ）、电位记录系与非神经细胞之间动态联系的基础上进行，这种在统（ＮｉｈｏｎＫｏｈｄｅｎ）、显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４０ＰＤＨＪ１１）体细胞间固有的完整联系通过神经细胞培养是不能和细胞培养箱（ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ

5、３１１１）。实现的。但是，在体研究最大的困难在于实验受制１．２脑片培养约因素太多，不便控制实验条件和观察实验结果。［７］脑片制备参照Ａｄａｍｃｈｉｋ等方法。将出生后体外培养的脑片包含了与在体脑组织相同的细胞种１０ｄ的乳鼠用７５％乙醇浸泡消毒后，断头取脑，迅类及细胞的三维空间结构，保存了正常完整的突触速置于预冷的解剖缓冲液中，分离出完整的海马。回路、受体分布、递质传递和其他生理功能［１］。脑片将海马放置于振动切片机的载物平台上，在解剖缓的体外长期培养为研究药物和毒物对中枢神经的慢冲液中以３００厚度进行切片。［２，３］［４］［５］μｍ性作用、神

6、经损伤与修复、神经发育等提供膜插件处理：在每一培养皿中放置一个膜孔为０．２２μｍ的膜插件，加入１ｍＬ含２５％马血清的收稿日期：２００４０５１７接受日期：２００４１０２２ＭＥＭ培养液使培养插件膜润湿至半透明，并于培养基金项目：广东省自然科学基金（０４０２０４３０）脑片前１ｈ放入３７℃细胞培养箱中以调节培养基的作者简介：王勇（１９６６－），男，重庆市人，医学博士，副教授，主要从事药理与毒理学、分子生物学研究。酸碱度。联系作者Ｅｍａｉｌ：１９６６７３＠１６３．ｃｏｍＴｅｌ：（０２０）脑片孵育：经过漂洗的每３～４块海马脑片被置６１６４３

7、５５５Ｆａｘ：（０２０）６１６４２９８３于同一膜插件上，在解剖镜下使其分布均匀。脑片·７２·ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５Ｆｅｂ；１９（１）Ｆｉｇ３．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｃｒｅｓｙｌｖｉｏｌｅｔｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｓｌｉｃｅｓｏｆｒａｔ．Ｔｈｅｓｅｃｔｉｏｎｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍａｊｏｒｎｅｕｒｏｎａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ｎｏｒｍａｌｎｅｕｒｏｎｓｏｆｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｉｎｐｉｃｔｕｒｅ．２．３神经元胞体形态表达明显增加（图５Ｂ）。对培养２０，４

8、０ｄ的海马脑对培养１０～４０ｄ的海马脑片进行焦油紫染色，片进行同样的观察，胶质细胞的激活反应未见减弱结果显示：在４０ｄ培养期间，海马脑片从ＣＡ１至（图５Ｃ，Ｄ）。ＣＡ３及齿状回都