uch-l3在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株中的表达

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1、http://www.paper.edu.cnUCH-L3在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株1中的表达12*3222张竹青，唐建武，孙成荣，王波，张宏颖，赵志英1.大连市中心医院病理科，辽宁大连（116033）2.大连医科大学病理学教研室，辽宁大连（116027）3.大连市第五人民医院肿瘤科，辽宁大连（116021）E-mail：zzqdl_2004@126.com摘要:背景与目的：转移是导致大多数肿瘤患者死亡的主要原因，肿瘤转移机制及防治已成为当今重要的研究课题。Hca-F和Hca-P是一对高度同源且淋巴道转移能力显著不同的小鼠腹水型肝癌细胞，其中Hca-F为高转移细胞

2、株，Hca-P为低转移细胞株。UCH-L3属泛素C-末端水解酶家族，泛素系统参与细胞周期、增殖及凋亡等生理病理过程。UCH-L3与肿瘤的关系研究甚少，目前尚未见有其与肿瘤转移相关联的报告。本研究观察UCH-L3基因编码蛋白在小鼠腹水型肝癌高、低淋巴道转移株（Hca-F、Hca-P）中的表达水平，分析它在这两个细胞株中表达的关系及意义，以进一步探讨UCH-L3基因在肿瘤转移过程中的作用及相关的分子病理学机制。方法：以Hca-F和Hca-P为研究对象，采用免疫细胞化学、WesternBlot和流式细胞仪检测UCH-L3蛋白在Hca-F和Hca-P两细胞株的表达。结果：免疫细胞

3、化学显示，UCH-L3蛋白在Hca-F、Hca-P细胞中均主要定位于胞浆；WesternBlot及流式细胞仪结果均显示UCH-L3蛋白在Hca-F中的表达量明显低于Hca-P（P<0.01和P<0.001）。结论：UCH-L3蛋白可能与肿瘤淋巴道转移相关，为研究肿瘤的淋巴道转移机制奠定了基础。关键词：肝肿瘤；淋巴道转移；UCH-L3蛋白中文分类号：R7301.引言转移是恶性肿瘤的最重要标志和最本质表现，也是肿瘤所致患者死亡的最主要原因。早期发现并防止肿瘤转移是改善病人预后的重要手段。因此，肿瘤转移机制及防治已成为当今肿瘤研究领域的热点。Hca-F和Hca-P是两株本实验室

4、自行建立的肿瘤转移机制实验模型。它们是一对高度同源的来自同一小鼠肝癌细胞克隆的不同亚克隆，经615小鼠局部皮下注射后，特异地向引流淋巴结转移。其中Hca-F为高转移细胞株，在615小鼠体内淋巴结转移率[1~3]>70%，Hca-P为低转移细胞株，转移率<30%。UCH-L3是泛素C-末端水解酶家族(UCHs)成员之一，泛素系统作用于细胞的许多过程如细胞周期、增殖、凋亡、膜蛋白细胞内摄作用[4,5]和信号转导等。本研究采用细胞免疫化学、WesternBlot和流式细胞术检测了UCH-L3蛋白在Hca-F和Hca-P中的表达情况，进一步探讨UCH-L3表达与肿瘤淋巴道转移的关

5、系，为解析肿瘤淋巴道转移机制提供新思路。2.材料与方法2.1材料高淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-F），低淋巴道转移力小鼠腹水型肝癌细胞（Hca-P），由大连医科大学病理教研室建株并保存。近交系615小鼠，雄性，体重18~22g，由大连医科大学病理教研室繁育并提供[辽实动质字（2000）028号]。主要试剂UCH-L3多1本课题得到教育部博士点基金（高低淋巴道转移力小鼠肝癌细胞株的比较蛋白组研究，20040161005）和国家自然科学基金（30572098）的资助。-1-http://www.paper.edu.cn克隆抗体购自SANTACRUZ公司。2.2细胞培

6、养将液氮冻存的Hca-F和Hca-P细胞迅速融化后清洗两次，离心并收集沉淀将沉淀物溶解6在1ml生理盐水中，以每只小鼠0.2ml细胞悬液（约2x10个肿瘤细胞）接种到2只615小鼠腹腔内，7天后无菌条件下抽取腹水并再以相同的量分别接种到2只615小鼠腹腔内传代，五天后无菌条件下抽取非血性腹水，离心去上清，经PBS（PH7.4）洗涤一次，再离心，去上清后，将细胞加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液（PH7.2）中于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。2.3免疫细胞化学6将培养的HCa-F和HCa-P细胞用PBS重悬为1×10/ml的细胞悬液，涂片标本经丙酮4

7、℃固定，H2O2灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加UCH-L3一抗，4℃过夜，滴加生物素化二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片，空白对照选择PBS代替一抗。2.4WesternBlot分析用超声破碎法裂解细胞，工作20s，间歇10s，重复20次，然后8000g、4℃离心30min取上清。Bradford比色法测定蛋白质浓度。以12.5%的SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品。电泳后的凝胶用转移缓冲液平衡30min，转至PVDF膜上40min。用5%TBS/BSA于37℃封闭2h，TBS清洗三次；一抗（山羊抗小鼠多