叶绿素的提取与分析测定

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1、植物叶绿体色素的分析一、实验目的：1、学会叶绿体色素的分离方法。2、掌握叶绿素的定量测定。一、3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。二、实验原理：1、叶绿体色素的提取：（1）原理：叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。（2）步骤：称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳

2、酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用2、叶绿体色素的分离：（1）原理：叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。（2）步骤：1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后

3、将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封住层析缸,直立于暗处层析。3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。如图所示：3、叶绿体色素的性质（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。由于荧光的光强度很弱只能在反射光的方向可以看到。如果我们将提取液放入试管中，观察反射光和透射光的颜色，反射光的颜

4、色即为叶绿素产生荧光的颜色为血红色。【如右图：】（二）氢代叶绿素&铜代叶绿素：C55H72O5N4Mg+H+===C55H74O5N4+Mg++H+C55H72O5N4Mg+Cu++===C55H72O5N4Cu+Mg++叶绿素取上述提取液少许于试管中，加入2滴浓盐酸，溶液呈现褐绿色，此时叶绿素变为去镁叶绿素。在褐绿色溶液中加入醋酸铜结晶少许，渐渐加热直至鲜绿色产生，这时铜已在叶绿素分子中代替了Mg的位置。�（三）皂化作用：叶绿素是含有两个酸根的酯，加碱可发生皂化反应，得到叶绿酸的盐、甲醇和叶绿醇，叶绿酸盐可溶于水。取3ml色素提取液，加lm120%KOH甲醇溶液,小心加热到沸腾,冷却

5、后,加入2ml苯,混匀，加入3m1水静止后得到两层溶液,上层是苯的胡萝卜素和叶黄素溶液，下层是叶绿酸a和叶绿酸b的钾盐溶液。另外在3ml上述色素提取液中直接加2ml苯，混匀，加入3ml水，对比皂化和没皂化溶液有何不同。照相记录实验结果。（左图为皂化溶液，右图没皂化）4、叶绿体色素的定量分析：叶绿体色素能够吸收一定波长的光，而让其他波长的光透过，这是叶绿体色素的光学特征之一,将色素的吸光度对波长作图，所绘制的曲线称为吸收光谱曲线。叶绿素在80%的丙酮溶液中，在长波方面的最大吸收峰分别位于663nm和645nm,同时该波长叶绿素的比吸收系数k为已知,根据Lambert-Beer定律,溶液中

6、叶绿素浓度C与溶液的吸光度A之间的关系式为：A663=82.04Ca十9.27Cb(1)A645=16.75Ca＋45.6Cb(2)解方程(1)(2),则得:CA(mg/L)=12.7A663-2.69A645CB(mg/L)=22.9A645-4.68A663CT(mg/L)=CA+CB=20.2A645+8.02A633计算叶绿素提取液的浓度，并根据提取液的体积植物组织的鲜重，算出样品中叶绿素a和叶绿素b的含量mg/g。样品中叶绿素a含量（mg/g）=提取液叶绿素a浓度（mg/L)*提取液体积（L）/叶片重量（g）样品中叶绿素b含量（mg/g）=提取液叶绿素b浓度（mg/L)*提取

7、液体积（L）/叶片重量（g）5、叶绿体色素的吸收光谱：叶绿体色素对可见光有吸收，测定叶绿素提取液对400～700nm波长的吸收，了解叶绿素提取液对400～700nm的可见光的吸光度同光的波长之间的关系。要求分别测定叶绿体色素、分离后的叶绿素a和叶绿素b的吸收光谱。三、实验材料：菠菜(Spinaciaoleracea)四、实验步骤：1.定性色素提取2.定量色素提取3.层析4.荧光现象5.氢、铜在叶绿素分子中的代替作用6.皂化反应7.定量测定8.吸