利用家蚕杆状病毒da26基因融合表达L-天冬酰胺酶成熟肽.pdf

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1、中国瘩让2013，34(2)：22—24ChjnaSeticuIture利用家蚕杆状病毒da26基因融合表达L一天冬酰胺酶成熟肽费建明孔莉施国方占鹏飞吴岩白雪川王文兵(浙江省湖州市农业科学研究院，浙江湖州313000；江苏大学生命科学研究院，江苏镇江212013)摘要L一天冬酰胺酶是一种有效的抗肿瘤药物，通过利用杆状病毒表达系统表达L一天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)与da26的融合蛋白，利用家蚕生物反应器大量生产该蛋白，为L一天冬酰胺酶在临床上的广泛应用打下基础。关键词家蚕；多角体；da26；成熟肽；L一天冬酰胺酶；大肠杆菌中图分类号$881．2文献标识码A文章编号1007—0982(2

2、013)02—0022—03L一天冬酰胺酶是一种酰胺基水解的酶类药自TaKaRa公司；TC一100培养基、FBS等购自Hy—物，广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病治疗j，Clone公司。PCR引物由上海生工生物工程技术服尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效_2]。目前，务有限公司合成。L一天冬酰胺酶的生产大多采用以大肠杆菌为宿主1．2试验方法的基因工程菌，表达产物主要位于细胞周质，用破碎1．2．1目的基因的克隆及序列测定根据Gen—细胞壁的方法纯化不仅步骤繁琐，还易导致蛋白污Bank中家蚕杆状病毒da26序列，设计da26引物，染。费建明等曾利用多角体融合表达了L一天在上游弓I物P1：TCCCC

3、CGGGATGAATTCTGT．冬酰胺酶，结果表明融合表达的基因产物具有活性，TCAACG的5端引进SmaI酶切位点；在下游引物但对多角体的形成有一定影响。da26基因编码杆P2：GC!坠Gc从TAGGcGTrAATATcAcTrrG的状病毒的一种包膜蛋白，可以吸附于多角体的外膜5端引进XbaI酶切位点(下划线表示酶切位点，以上。将L一天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)与da26下相同)。根据大肠杆菌JM109基因组DNA序列融合表达，可以通过超声裂解和差速离心法将外源中L一天冬酰胺酶成熟区的DNA片段，设计大肠杆蛋白分离纯化I6j。本实验通过此方法与多角体融菌引物，在上游引物P3：GCTC

4、TAGAGCCCATCAC—合表达的方法作比较，分析较优的表达形式，促进我CATCACCATCAC的5端引进XbaI酶切位点；在下国历史悠久的蚕桑业向更高层次发展。游弓l物P4：ACATGCATGCTI?AGTACTGATTGAAGA．TCTGCT的5端引进SphI酶切位点。PCR扩增的1材料与方法da26和asp(S)产物分别用XbaI单酶切，琼脂糖凝1．1实验材料胶电泳后回收酶切产物并作连接，得到Da26．asp()大肠杆菌DH5c~、pFastbacdual载体、DH10BacTM、连接产物。用Da26-asp(s)连接产物做模板，da26Bran细胞，由江苏大学生命科学研究院医学组实

5、验上游弓l物Pl：TCCCccGGGATGAATYCTGTTCA．室保存。SmaI、XbaI、SphI等限制性内切酶，r4CACG，asp(s)下游引物P4：ACATGCATGCTrAG—DNA连接酶、质粒柱抽试剂盒、胶回收试剂盒等购TACTGA1TrGAAGATcTGCT再作PCR扩增。电泳回收后与T载体连接并转化大肠杆菌。质粒抽提等收稿日期：2013一O1—22；修回日期：2013—03—24基因操作参照文献[4]的方法进行。经酶切鉴定阳资助项目：浙江省科技计划项目(编号2011C32005)。作者简介：费建明(1962一)，男，浙江湖州，硕士，高级农艺师。性的质粒送上海生工生物工程技术

6、服务有限公司测Tel：0572—2821600，E-mail：ajOm@163．corn序。目