高效液相色谱法-概论课件

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1、高效液相色谱法HPLCWhatdoesHPLCmean?HighPressureLiquidChromatographyHighPerformanceLiquidChromatographyHighPricedLiquidChromatographyHighPatienceLiquidChromatography一概述1、历史2、特点3、方法局限性4、与气相色谱比较5、与经典LC比较6、色谱学文献1、历史1903年色谱法问世1931年库恩（Kuhn）分离胡萝卜素1941年马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法1958年美国生物化学家

2、斯坦因(W.H.Stein)和莫尔（Moore）研制出氨基酸分析仪60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制色谱法问世茨维特1903年3月21日，他在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法Chromatography，茨维特被世人公认为色谱的创始人。茨维特工作的主要贡献：▲（采用吸附色谱）成功分离了叶绿素a和叶绿素b▲发明

3、了伟大的色谱法库恩（Kuhn）分离胡萝卜素1931年，德国的Kuhn和Lederer采用类似Tswett的柱色谱方法，采用纤维状氧化铝和碳酸钙作吸附剂，把结晶状的胡萝卜素分离成α-和β-两种同分异构体，而且确定了它们的分子式。随后他们分别从植物叶片和蛋黄中分离得到叶黄素，才使色谱法引起科学界的重视。1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，因此获得了1938年的诺贝尔化学奖。Kuhn工作的贡献：▲证明了蛋黄叶黄素是氧化类胡萝卜素的混合物▲证实了色谱法可以用来进行制备分离马丁和辛格提出液液分配色谱Martin和Synge用水分饱和的硅胶

4、作固定相，以含有乙醇的氯仿作流动相，甲基橙作显色剂（指示氨基酸的位置）分离乙酰基氨基酸[5]混合物：苯丙氨酸、亮氨酸-异-亮氨酸和脯氨酸-缬氨酸-蛋氨酸等三组氨基酸。为此，Martin和Synge获得1952年度的诺贝尔奖。他们的主要贡献☆首次提出分离过程的理论/数学处理----塔板理论，这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量地描述、评价分离过程；☆在色谱过程中最早引入分配平衡取代吸附平衡，即采用分配色谱进行分离。此外，将一种液体固定在适当的载体上，使第二种液体流过前者而实现分离，也是一个很重要的成就。☆提出了色谱法进

5、一步发展最有远见的预言：一是“流动相可用气体来代替，对分离更有好处”；二是“使用非常细颗粒的填料和柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板”氨基酸分析仪1958年美国生物化学家斯坦因（W.H.Stein）和莫尔（Moore）研制出氨基酸分析仪（一种低压高效液相色谱仪），并用它确定了核糖核酸的分子结构。此后，氨基酸分析仪一直成为蛋白质和酶结构的重要工具，为此他们获得了1972年诺贝尔化学奖。高效液相色谱仪的成功研制60年代末，由于生命科学发展需要，对一些高极性、大分子量、热不稳定和离子型化合物的分离也促使高效液相色谱的研究。荷瓦斯（Horvath，

6、1967）、哈伯（Huber，1967）、科克兰（Kirkland，1969）三个研究小组分别报道高效液相色谱仪的研制主要贡献☆高效填料：细颗粒、耐压；特别是键合固定相研制☆高压泵:高精密度流量、高压和耐腐蚀流路通道（克服细填料带来的流速慢的缺点，同时加快了传质过程）☆仪器检测：高灵敏度连续检测高效液相色谱的重要特征一是由经典“开放柱液相色谱”向“密闭柱液相色谱”方向发展，实现了分离分析一体化；二是色谱柱的“现代化”，即采用小颗粒高效固定相和高压泵输送流动相，强化了两相的传质，实现了高效快速分离。HPLC是整个70～90年代分析化学发展最为迅速的一个分

7、支，部分地满足了迅猛发展的生命科学的需要。由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性HPLC应用范围广，适于非挥发性和热不稳定组分的分析对被测物质活性影响小，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。NumberofmentionsofHPLCinChemicalAbstracts极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量2．特点高效：柱效可

8、达10万理论塔板数高选择性：高柱效且流动相参入分离高灵敏度：检测器有较高的灵敏度快速分析：高压