高效液相色谱法课件 (2)

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1、第二章高效液相色谱法一、高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件三、影响分离的因素四、高效液相色谱法的主要分离类型2021/6/24液相色谱仪（1）2021/6/24液相色谱仪（2）2021/6/24液相色谱仪（3）2021/6/24液相色谱仪（4）2021/6/24液相色谱仪（5）2021/6/24一、高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2021/6/241．高效液相色谱法与气相色谱法比较（1）应用范围不同气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。据统计

2、只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70~80%。（2）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中气体的传质速率要快得多。2021/6/24（3）液相色谱能完成难度较高的分离工作①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。②液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。③液相色谱通常

3、在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择，而气相色谱一般都在较高温度下进行的。（4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。2021/6/242．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosor

4、b－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.2021/6/24小结综上所述，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。2021/6/24二、流程及主要部件1.流程高压输液系统——进样系

5、统——分离系统——检测系统——数据处理系统2021/6/24Agilent1100LC的主要部件2021/6/242.主要部件(1)高压输液系统主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等高压输液泵压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。基本要求：应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性2021/6/24(2)梯度淋洗装置外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶

6、剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2021/6/24(3)进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，也可配备自动进样装置。其结构如图所示：2021/6/24(4)高效分离系统色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2021/6/24(5)高效液相色谱检测器紫外光度检测器（UVD）

7、：最小检测量10-9g·mL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。2021/6/24光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2021/6/24（6）数据处理系统色谱工作站的功能：色谱参数的选择和设定；自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使

8、用。2021/6/242021/6/241.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。三、影响分离的因素2021/6/24