免疫组化染色SP法.doc

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1、免疫组化SP法一．实验原理SP法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000.同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。根据研究，SP大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。大量的酶将保证

2、SP具有很高的敏感性。SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。二．试剂来源三．操作步骤1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min以使切片紧密粘附。2．切片常规脱蜡3．30%过氧化氢1份+蒸馏水10份混合，室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次4．热修复抗原：将切片浸入0.01M构橼酸盐缓冲液（PH6.0），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。1．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗2．滴加一抗（1:300）4℃过夜。PBS（PH7.2~7.6）洗2mi

3、n，共洗三次。3．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100），37℃30min。PBS（PH7.2~7.6）洗2min，共洗3次。4．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100）PBS（PH7.2~7.6）洗5min，共4次。5．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。取1ml蒸馏水，加设计盒中A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min之间，蒸馏水洗涤。6．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察