乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、·464·国际检验医学杂志2014年2月第35卷第4期IntJLabMed，February2014，Vo1．35，No．4·检验技术与方法·乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立何紫琪，李从荣△，童永清(武汉大学人民医院检验科，武汉430060)摘要：目的建立一种采用Lightcycler系统进行HBVDNA实时荧光定量PCR的方法，并探讨其临床应用价值。方法针对HBV基因组S区设计一对扩增引物，并通过预实验严格优化反应体系的组成和条件；将T栽体与HB"RT区扩增后纯化的产物进行连接反应，然后转染大肠杆菌(DH5a)，经蓝、白斑筛选后挑取阳性茵落，提取

2、质粒，制备外标准品。结果用于制成外标准品的质粒经1：1O的缓冲液倍比稀释，制作标准曲线，线性方程为：y一一3．344X+37(P。一0．9999)；通过检测已知浓度并经倍比稀释的HBVDNA，表明其最低检测限为5×10IUVmL；拷贝数介于5×1O～5×10IU／mI之间的HBVDNA浓度与ct值具有良好的线性关系。结论外标法实时荧光定量PCR是一种定量相对准确、灵敏度高、特异性强、操作相对简便的方法；该方法可用于乙型肝炎患者病情监测，有效指导临床用药；联合该法与血清标志物检测，可更准确评价HBV感染者病情。关键词：肝炎病毒，乙型；聚合酶链反应；质粒DOI：1

3、0．3969／j．issn．1673—4130．2014．04．035文献标识码：A文章编号：1673—4130(2014)04—0464—03EstablishmentoffluorescencequantitativepolymerasechainreactionassayforHBVDNAdetectionHeZiqi，LiCongrong，TongYongqing(DepartmentofCHnicalLaboratory，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan，Hubei430060，China)Abstract：

4、0,bjectiveToestablishahighsensitiveandreproductivereal-timePCRassayforquantificationofHBVDNAusingtheLightCyclerSystem．MethodsApairofprimersweredesignedtargetingSareainHBVgenome，andthereactionconditionandcomponentoftheamplificationsystemhavebestrictlyoptimizedbypre—experiments．Aligat

5、ionreactionwasmadebetweenvectorTandtheamplificationandpurificationPCRproductofHBVreversetranscriptase，thenthecompetentK．eoli(DH5~)weretrans—fectedbytheligationproduct．Thepositiverecombinant—clonecouldbeoptionedthroughblue-whkeselection．Thentheplasmidswereextractedandmadeintoexternal

6、standardsubstance．ResultsStandardcurvewasmanufacturedusingserialdilutionsofHBVgenomicDNAofknownconcentrations。andthelinerequationandcorrelationcoefficientwasY=一3．344X+37and0．9999re—spectively．Itturnedoutthatthelowerlimitofdetectionwas5×10IU／mLwithagoodlinearcorrelationrangeingin5×10

7、一5×10IU／mL．ConclusionExternalstandardreal—timePCRisamethodthatisrelativelyaccurateinquantitativeanalysis，highlysen—sitive，specificandconvenientinhandling．Keywords：hepatitisBvirus；polymerasechainreaction；plasmidHBV属于嗜肝DNA病毒科的双链DNA病毒，它可引起CTCAAGGTCGGTCGTT4GACA-3；一对HBVS区特异急、慢性肝炎。据世界卫生组织

8、统计，全球约有2O亿人感染引物，扩增区