应用腺病毒载体系统构建1.3拷贝乙型肝炎病毒重组腺病毒载体-论文.pdf

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1、·17l8·中华实验外科杂志2014年8月第31卷第8期ChinJExpSurg，Au耻．：·实验研究·应用腺病毒载体系统构建1．3拷贝乙型肝炎病毒重组腺病毒载体屈振亮王西墨【摘要】目的应用腺病毒AdEasy系统构建含1．3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)基因组的腺病毒载体，并鉴定目的蛋白的表达。方法采用基因重组技术将4．1kb的1．3拷贝HBV基因序列克隆在腺病毒穿梭质粒上，通过在大肠杆菌内与骨架质粒的同源重组，构建重组腺病毒质粒，经293T细胞包装后产生重组腺病毒，感染肝癌细胞后检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、HBVDNA

2、和乙型肝炎病毒x蛋白(HBX)蛋白的表达，以转HBV基因组的HepG2．2．15肝癌细胞株为对照，同时检测上述指标含量。结果双酶切下的1．3拷贝HBV序列成功克隆在腺病毒穿梭质粒上，与骨架质粒同源重组后的腺病毒质粒转染293T包装细胞后产生了重组腺病毒，感染HepG2细胞后能在细胞培养上清中检测HBsAg和HBeAg的含量分别为70．70、5．50IU／ml，HBVDNA含量为1．2x10copies／ml。同期检测的HepG2．2．15细胞内HBsAg和HBeAg的含量分别为3．51、44．85IU／ml，HBVDNA含量为7．4×10copies／m1。

3、Westernblot检测可见被感染的HepG2细胞有HBX蛋白的表达。结论应用AdEasy系统成功构建含1．3拷贝HBV基因组的重组腺病毒载体，经包装细胞产生的病毒感染靶细胞后能检测到HBV抗原的表达。【关键词】肝炎病毒，乙型；腺病毒载体；同源重组；抗原检测Constructionofrecombinantadenovirusvectorcontaining1．3·foldoverlengthhepatitisBvirusge-nomebytheAdEasysystemQuZhenliang，WangXimo．DepartmentofSurgery，死nn

4、NankaiHospitaZ．Tianiin300100．ChinaCorrespotutingauthor：QuZhenliang，Email：quzhenliang@medmail．com．cn【Abstract】ObjectiveToconstructrecombinantadenovirusvectorcontaining1．3-foldoverlengthhepatitisBvirus(HBV)genomeandtoidentifytheexpressionofthetargetedproteins．Methods1．3一f0ldoverlengt

5、hHBVgenomeof4．1kilobaseswasobtainedbydigestingtheplasmidpT—HBV1．3withrestrictionendonucleasesandsubclonedintoshuttlevectorpAdTrack—TOX．TheresultantvectorpAdTrack—HBV1．3waslinearizedbyendonucleasePmeIandelectroporatedintocompetentE．coliBJ5183containingthead—enoviralbackboneplasmidfo

6、rhomologousrecombination．Thentheconfirmedrecombinantadenovirusvec—torpAdEasy—HBV1．3wasconstructedandtransferredinto293Tpackagingcells．Therecombinantadenovi—rusAd—HBV1．3wasgeneratedandamplifiedin293Tcells．Her'G2cellswerecuhuredinDMEMplus10％fetalbovineserun(FBS)andinfectedwithAd—HBV1

7、．3．Ninety'sixhafteririfection．thesupernatantwascollectedandassayedforHBsAg．HBeAgandHBVDNAcontent．Theinfectedcellswerewashed5to6timeswithPBSandpelletscollectedforproteinextraction．HepatitisBvirusx—proteinfHBX)expressionwasdetectedbyWesternblotting．Correspondingly．HepG2．2．15wasusedas

8、positivecontrolcellmodelas