腺病毒载体构建.ppt

《腺病毒载体构建.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、重组腺病毒的构建腺病毒Adenovirus最初由人类腺样增殖体组织培养中分离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒症状、呼吸系统不适等。腺病毒腺病毒是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞

2、内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中.ITRΨE1a/E1bE2E3E4ITR腺病毒的基因及其功能腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表达。早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。E2蛋白涉及AdDNA复制E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统E4蛋白调

3、节有效的晚期基因转录腺病毒分类第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用，体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛，一般常用Ad5型腺病毒）第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉害，应用局限。第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒基因，仅保留ITR和包装信号序列。这

4、一载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础重组系统由2种质粒构成：一、包含全部（或右侧大部分）腺病毒基因组DNA的大质粒，即骨架质粒二、小的穿梭质粒，其带有目的基因的表达盒以及表达盒两侧的与大质粒上的目的基因拟插入部位同源序列（左右臂）AdEasy腺病毒载体系统腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处于分裂状态的细胞。可经不同途径进入不同组织(可以在

5、肠道内繁殖，也可以在呼吸道内繁殖。改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。稳定性高宿主范围广感染性强包装容量大安全性好几种病毒载体的区别腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒病毒基因组组成双链DNA单链RNA单链DNA载体容量<8kb<8kb<6kb基因整合功能无，病毒基因组游离于宿主基因组之外，瞬时表达外源基因有，病毒基因组整合到宿主基因组，长时间、稳定

6、表达外源基因有表达丰度高水平表达中中表达时间快（1-2天）慢（2-4天）快（1-2天）感染细胞类型分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞，适用于难转染细胞分裂cell，但在干细胞中表达效率低滴度U/ml1012109109四环素诱导系统不可以TET-ON,TET-OFF不可以毒性作用细胞毒性遗传毒性遗传毒性腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒免疫原性高免疫原性低免疫原性低动物模型不能得到转基因动物可产生转基因动物可以，但很难安全系数高高中能否用于miRNA可以可以不可以RNAi病毒进入细胞往往引起细胞内

7、干扰素反应，不适合做RNAi实验适合，是优选工具可以基因过表达包装容量大，可以满足较大基因的包装，是过表达基因的优选工具包装容量有限，过表达的基因过大时病毒滴度受到影响包装容量有限，过表达的基因过大时病毒滴度受到影响常见应用1、体外基因转导2、基因治疗同上体外基因转导，突变筛选，功能基因库构建谢谢观看！2020