安捷伦1260高效液相色谱培训20130305

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1、设备培训-----高效液相色谱2013.05.14概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。色谱原理色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同在固定相中滞留时间不同从而先后从固

2、定相中流出。又称为色层法、层析法高效液相色谱仪高效液相色谱仪的结构：一般可分为5个主要部分：高压输液系统、进样系统、色谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。一、高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液装置、脱气装置、高压输液泵、过

3、滤器等组成，其中高压输液泵是核心部件。输液泵分为恒流泵和恒压泵两种，但是目前恒流泵已经基本取代了恒压泵。1、输液泵应具备性能:A、流量稳定，其变异系数应小于0.5%，这对定性定量的准确性至关重要；B、流量范围宽，分析型应该在01-10mL/min范围内连续可调，制备型应能达到100mL/min；C、输出压力高，一般应能达到150-300kgf/cm2（kgf/cm2=98.0665kpa）；D、液缸溶剂小；E、密封性好，耐腐蚀。2、输液泵的使用和维护注意事项A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒；

4、B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会使高压密封环变形。E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定。二、进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm）

5、，所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。1、进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱柱系统的压力、流量影响小。2、进样方式：隔膜泵进样、停留进样、阀进样、自动进样。三、色谱分离系统色谱分离系统包括：色谱柱、固定相和流动相。其中，色谱柱是其核心部分。1、色谱柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑

6、的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。2、色谱柱的类型色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。a、常规分析柱（常量柱）一般色谱柱长10～30cm，内径为2～5mm（常量4.6mm，国内有4mm和5mm），凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。b、窄径柱（细管径柱、半微量柱）柱长10～30cm，内径1～2mmc、毛细管柱（微柱）内径0.2～0.5mmd、半制备柱，内径>5mm。e、实验室制备柱，柱长10～30cm，内径20～40mmf、生产制备柱，内径可达几十厘米。注：一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂

7、由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。3、色谱柱的使用和注意事项A、避免温度和压力的急剧变化及任何机械振动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下会影响柱内的填充情况；柱压突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流量时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。B、应逐渐改变溶剂组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改为全部是水，反之亦然。C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明