USP1223-微生物替代方法的验证.doc

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1、微生物替代方法的验证本章的目的是为官方法定微生物学方法的替代方法的验证提供指导。由于如经济、产量、方便等各种原因，对于那些通论里的微生物回收率和鉴定，微生物检验实验室有时候会使用其他的检测方法。对于这些方法的验证是必要的。通用需知中的检测和分析部分提供了对这些替代方法的验证指导。这部分内容中提到，如果发生争议，以法定方法的结果为准。替代微生物学方法的验证研究应考虑到大量的变量，例如使用传统的平皿计数法进行微生物检测时，其结果的RSD（15％～30％）经常会比常用的化学分析的RSD（1％～3％）大。许多传统的微生物学方法都受制于取样

2、误差、稀释误差、涂平皿误差、培养误差和操作误差。法定方法的验证定义了准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、限度、重现性和稳定性在分析方法中应用的特征。这些定义不太适用于至少等价于法定方法的替代微生物学方法验证，此替代方法给出了相似性质的问题（参阅“通用的关系”中检测和分析的步骤部分）。关键问题是替代方法得到的结果是否等价于，甚至好于传统方法得到的结果。其他行业组织也提供了替代方法的验证指南*。一个新的或改良的方法的适用性要经过该替代方法与美国药典法定方法的比较来证明。本章定义的一些特性可能被用于建立这种比较。微生物学检测的

3、种类对检测中以替代方法命名的部分进行鉴别对验证来说很重要。比如说，很多技术都可用来鉴定活细胞的存在。这些技术可能应用于各种检测（如生物负载，无菌检测），但实际上他们不能完全代替检测中的重要部分。比如说，一个用滤膜过滤的无菌检测可能用法定方法进行到把加工过的滤器和回收培养基放一起，然后活细胞的存在可能用一些可用的技术来证明。这个应用的验证就要求验证所应用的回收系统而不是整个检测。对于微生物学检测有三种特殊的测定，包括样品中是否有微生物的判定检测；微生物数量的定量检测（或样品中特殊亚群的计数）和用于鉴定微生物种类的检测。本章不介绍微生

4、物的鉴定。微生物存在或缺乏的定性试验这种试验的特点是以液体培养基的浊度作为判定测试样品中存在活体微生物的依据。这个试验最常见的例子是无菌检测。这个试验的其他例子有那些用于判断样品中某一特定微生物是否存在的检测（如：饮用水中的大肠菌群和口服制剂中的大肠埃希氏菌）。微生物的定量检测平板计数法是这类用于估算样品中活体微生物数量的检测中最常用的例子。滤膜过滤法和最大或然数（MPN）多管法是这些检测的另一些例子。后者发展成为一种估算无法用于直接涂板法和膜过滤法的样品中存在的活体微生物数量方法。通用的关系一个微生物学方法的验证是实验方法建立的

5、过程，与传统方法相比，方法的性能特征符合应用要求。例如，没必要对在抗菌功效测试中用的新的定量方法的整个等价内容进行比较研究来验证，因为重要的是计数用的新方法和平板计数法（目前的计数方法）之间的比较。作为定量试验，从本质上说，它们产生用数字表示的数据，允许使用参数统计方法。与此相反，定性的微生物分析，如：上述例子中的无菌检测，可能要求用非参数统计方法进行分析。化学分析中分析方法的验证遵循在法定方法验证（1225）中描述的成功建立的参数。微生物学方法的验证也服从其中一些关系，虽然要考虑到微生物分析的特殊性质（见表1）。表1各种微生物学

6、检验类型的验证参数参数定性检测定量检测准确性NoYes精确性NoYes专属性YesYes检测限YesYes定量限NoYes线性NoYes运用范围NoYes稳定性YesYes可重复性YesYes重现性YesYes样品中活体微生物定性检测的验证专属性单指促生长实验，已经进行该实验项目一个替代定性微生物学方法的专属性是指它用于检测可能存在于受测样品中的一系列微生物的能力。这种关系被恰当地命名为定性方法的培养基促生长。这种定性方法依靠菌落的生长来证明微生物的存在与否。但是，对于那些不需要菌落生长来指示微生物存在的方法，微生物分析的专属性保

7、证了检测系统中的外来物质不影响检测。检测限未进行此相关实验检测限是指在规定的实验条件下可检测出来的样品中的最低微生物数量。微生物学检测限决定了微生物存在与否，比如，10克中没有检出沙门氏菌属。由于微生物学本身的性质，检测限是指任何稀释或培养步骤之前的原始样品中所含的微生物体的数量而不是检验时检出的微生物体数量。用一种方法来证明一个定量分析的检测限就要用此方法去评估替代方法和法定方法。评估办法就是培养少量的挑战微生物（不多于5CFU/皿）然后计数回收率。调整培养水平使法定方法中有至少50%样品中微生物出现生长现象。一个试验的检测限经

8、过多次重复试验（至少5次）才能确定，因此这个试验要重复多次。这两个方法检测低浓度培养物的能力可以用κ2检验来表示。用于证明这两种方法等效性的第二种方法是最大或然数法。在这种方法中，替代方法和法定方法均要用到10倍系列稀释的5管菌液。然后用等价的接种