微生物限度方法学验证.doc

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1、微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表1菌种菌种名称菌种代数菌种状态厂家大肠埃希菌[CMCC(B)44102]3正常浙江省食品药品检验研究院金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]3正常枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]3正常白色念珠菌[CMCC(F)98001]

2、3正常黑曲霉[CMCC(F)98003]3正常乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]3正常表2培养基培养基名称批号厂家营养肉汤培养基150222北京三药科技开发公司改良马丁培养基150134北京三药科技开发公司改良马丁琼脂培养基150215北京三药科技开发公司营养琼脂培养基150317北京三药科技开发公司玫瑰红钠琼脂培养基150323北京三药科技开发公司胆盐乳糖培养基150127北京三药科技开发公司胆盐硫乳琼脂培养基150214北京三药科技开发公司四硫磺酸钠亮绿培养基150416北京三药科技开发公司MUG培

3、养基150122北京三药科技开发公司曙红亚甲蓝琼脂培养基150137北京三药科技开发公司三糖铁琼脂培养基150207北京三药科技开发公司表3对照用培养基对照培养基名称批号厂家营养肉汤对照培养基135004-201103中国食品药品检定研究院营养琼脂对照培养基135003-201002中国食品药品检定研究院玫瑰红钠琼脂对照培养基135005-201002中国食品药品检定研究院胆盐乳糖对照培养基135006-201404中国食品药品检定研究院胆盐硫乳琼脂对照培养基135010-201102中国食品药品检定研究院四硫磺

4、酸钠亮绿对照培养基135020-201101中国食品药品检定研究院MUG对照培养基135012-201001中国食品药品检定研究院曙红亚甲蓝琼脂对照培养基135009-201102中国食品药品检定研究院三糖铁琼脂对照培养基表4试剂试剂名称批号级别磷酸二氢钾130826分析纯氢氧化钠20150117分析纯氯化钠20140714分析纯聚山梨酯8020141011化学纯95%乙醇15070722药用级二甲氨基苯甲醛20140402分析纯盐酸20140533分析纯稀释液：（1）pH6.8缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钾

5、溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯800.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金

6、黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下

7、放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。四、验证内容1、计数方法验证将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的

8、规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。2、适用性检查2.1细菌、霉菌、酵母菌取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1m