抗siRNA的GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定细胞系的构建.pdf

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1、生物技术通讯LETFERSINBIOTECHNOLOGY⋯Vo1．·2—6一一No．·2一Mar‘，20—15doi：10．39698．issn．1009-0002．2015．02．012研究报告抗siRNA的GFP—Plkl同义突变表达载体及其稳定细胞系的构建李伟，李峰生，于楠，刘萱，李平，江其生，曹诚1．军事医学科学院生物工程研究所，北京100850；2．第二炮兵总医院核与辐射损伤实验室，北京100088[摘要]目的：构建GFP-Plk1同义突变表达载体及其稳定转染细胞系。方法：设计Polo样激酶1(Plk1)siRNA序列及相对应的同

2、义突变引物，并利用二次PCR方法扩增Plk1基因，定向克隆到pRex-EGFP—IRES—Hygo载体中，构建pRex—EGFP—rPlk1一IRES—Hygro表达载体；利用逆转录病毒感染的方法，构建HeLa／GFP—rPlk1稳定细胞系；利用免疫印迹及激光共聚焦显微镜，验证Plk1siRNA的干扰效果及稳定细胞系的构建。结果：双酶切鉴定和测序结果表明构建的pRex—EGFP—rPlk1一IRES—Hygro正确；免疫印迹实验证明Plk1siRNA序列可以有效抑制HeLa／GFP—rPlk1细胞中内源性Plk1蛋白的表达，但不能干扰掉外源

3、GFP—rPlk1蛋白；在荧光共聚焦显微镜下，观察到有丝分裂的前中期和末期，GFP—rPlk1分别定位于着丝粒和中间体上。结论：构建了Plk1同义突变表达载体pRex-EGFP—rPlk1一IRES—Hvgro和HeLa／GFP—rPlk1稳定细胞系，为下一步研究Plk1在有丝分裂期的调控机制提供了模型。[关键词]Plkl；抗siRNA；同义突变；稳定细胞系[中图分类号]Q78[文献标识码]A[文章编号]1009—0002(2015)02—0207—04ConstructionofSynonymousMutatedGFP-PlklExpre

4、ssionVectorwithResistancetosiRNAandStablyTransfectedCellsLIWei，LIFeng—Sheng，YUNan。，LIUXuan，LIP，JIANGQi-Sheng，CAOCheng1．BeijingInstituteofBiotechnology，Beijing100850；2．LaboratoryofNuclearandRadiationDamage，GeneralHos—pitaloftheSecondArtillery，Beijing100088；ChinaCo—correspon

5、dingauthors，JIANGQi—Sheng，E-mail：jqs598@sina．corn；CAOCheng．E-mail：cao@nic．bmi．ae．cn【AbstractJ0bjective：ToconstructGFP—Plk1synonymousmutationexpressi0nvectorandstablvtransfectedce11s．Methods：ThesiRNAandsynonymousmutationprimerstargetingPolo—likekinase1(Plk1)weredesigned．Plk

6、1genewasamplifiedbytwostepsPCRandtheninsertedintovectorpRex—EGFP—IRES—Hygrot0constructDRex—EGFP—rPlk1一IRES—Hygroplasmid．HeLa／GFP—rPlk1stablytransfectedcellswereconstruetedthroughretroviralin—feetion，immunblotingandeonfoeallaserscanningmicroscopywereusedtoverifyPlk1siRNAint

7、erferenceandsta—bilityofconstructedcells．Results：DoubleenzymesdigestionandsequencingresuhsshowedthattheconstructedvectorpRex—EGFP—rPlk1一IRES—Hygrowascorrect．ImmunoblottingresultsdemonstratedthatPlk1siRNAcouldef-feetivelyinhibittheexpressionofendogenousPlk1proteinbutnotexog

8、enousGFP—rPlk1protein．F1uorescencecon．，focalmicroscopyimagesshowedthatduringprometaphasea