豚鼠弓形虫抗体ELISA检测方法的建立及应用.pdf

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1、Aug．2013．33(4)实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicine275doi：10．3969／j．issn．1674—5817．2013．04．006豚鼠弓形虫抗体ELISA检测方法的建立及应用李晓波，付瑞，巩薇，王吉，卫礼，王淑菁，岳秉飞，贺争鸣(中国食品药品检定研究院一实验动物资源研究所，北京100050)[摘要】目的建立以弓形虫重组抗原的豚鼠弓形虫抗体ELISA方法，并进行初步应用。方法根据重组抗原的工作浓度包被酶标板，确定酶标二抗浓度，对方法的特异性、灵敏度、稳定性和重复性等进行测试。结果确定酶

2、标二抗最佳稀释度为1：8000；与豚鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒(sv)、肺炎病毒(PVM)TL呼肠孤3型(Reo3)阳性血清均无交叉反应；对已知阳性血清的检测上限可达1：2560；6个月的稳定性试验显示Ao值的相对偏差均小于15％；批内变异系数(cv)5．7％～9．5％，批间变异系数(CV)I．9％～9．O％；对182份样本的检测表明豚鼠弓形虫抗体阳性率为7．14％(13／182)，与IFA检测结果的符合率为100％，与商品化试剂盒的阳性符合率为92-3％，阴性符合率为100％。结论建立的豚鼠弓形虫重组抗原ELISA检测方法可用以弓形虫抗体

3、的常规检测。【关键词]豚鼠；弓形虫；重组抗原；酶联免疫吸附试验【中图分类号】Q95．33【文献标识码]A[文章编号]1674—5817(2013)04．0275—04弓形虫(学名为冈地弓形虫，Toxoplasmagondii)，初步应用。球虫目，肉孢子虫科，弓形虫亚科，弓形虫属，是一种全球性人畜共患寄生虫病，为专性细胞内寄1材料与方法生原虫，在实验动物的各种有核细胞中均可寄生和繁殖⋯，不仅危害动物健康，干扰动物实验，还1．1材料弓形虫重组抗原：深圳飞鹏生物技术有限公司可通过实验动物传给饲养和实验人员[2l引，国标中提供(来自从人分离的弓形虫，接种实验小鼠进行将

4、弓形虫列为所有实验动物的必检项目。增殖后提取的核酸)；可拆卸酶标板：购自深圳金灿免疫学诊断是弓形虫感染调查与诊断的常用方华公司；羊抗豚鼠IgG—HRP：购自KPL公司；豚鼠弓法，目前常用的诊断技术有免疫荧光法(IFA)、间形虫抗体血清对照，弓形虫抗原片均由本室制备保接血凝法(IHA)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等。存Iq：动物弓形虫IgG抗体酶免试剂盒：珠海经济特ELISA敏感特异，操作简便，是诊断弓形虫感染应用最广的技术f41。作者以弓形虫人工重组抗原区海泰生物制药有限公司；待检样本均来自动物生产单位送检血清。代替传统的虫体或虫体成份为诊断抗原，建立了弓

5、形虫抗体的间接ELISA检测方法，并对方法进行了1．2方法1．2．1重组抗原的包被按照产品说明，将弓形虫重组抗原进行1：5000稀释包被酶标板。【收稿日期】2012—11-291．2．2酶标二抗最佳工作浓度的确定豚鼠弓形虫【基金项目】国家科技支撑计划(编号：2011BAI15B01)抗体阳性和阴性血清1：40稀释(GB／T14926．50．【作者简介]李晓波(1980一)，男，硕士，研究方向：实验动物免2001)，羊抗豚鼠IgG—HRP按1：1000~1：8000倍疫学。E—mail：lxb8493059@yahoo．com．cn【通讯作者】贺争鸣，研究员，研

6、究方向：实验动物微生物学，比稀释，测定A4o的吸光值来确定二抗的最佳浓度。E—man：zhengminghe57@163．com1．2_3判断标准阴、阳性对照成立的情况下，待276实验动物与比较医学LaboratoryAnimalandComparativeMedicineAug．2013．33(4)检血清孔。值≥0．2，同时待检血清孔9o值／阴2结果性对照孔Ao值≥2．1，判为阳性；否则为阴性【。1．2．4特异性试验用建立的方法检测豚鼠淋巴细2．1酶标二抗最佳工作浓度胞脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒(sv)、肺炎病毒不同浓度的羊抗豚鼠IgG．HRP反应后，测

7、定fPVM)及呼肠孤病毒III型(Reo3)标准阴、阳血清，A49o值，结果在1：8000浓度时P／N值最高，确同时设弓形虫阴、阳对照。定酶标二抗的最佳工作浓度为1：8000。1．2．5灵敏度试验弓形虫抗体阳性血清1：40倍2．2特异性试验比稀释，用最适反应体系进行检测，测定结果为在Tox阴、阳对照成立的条件下，与豚鼠淋阳性的最大稀释比例。巴细胞脑膜炎病毒(LCM)、仙台病毒、肺炎病毒1．2．6稳定性试验将同一批次的抗原板置4℃分(PVM)及呼肠孤病毒III型(Reo3)阴、阳血清均无特别放置0、1、2、4和6个月，检测同样的5份异反应。阳性和5份阴性血清，每

8、份血清重复测3次，计2．3灵敏度试验算