雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究.pdf

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1、2014年43卷第5期JClinDermatol，May2014。Vo1．43。No．5267论著雷帕霉素对人角质形成细胞系HaCaT细胞自噬诱导效应及其分子机制的初步研究陈旭，徐松，黄丹，鞠梅，陈凫，李新宇，顾恒(中国医学科学院、北京协和医学院皮肤病研究所，江苏省皮肤病与性病分子生物学重点实验室，江苏南京210042)[摘要]目的：初步探讨雷帕霉素在不同浓度和不同孵育时间下，对人角质形成细胞系HacaT细胞自噬的诱导效应及其分子机制。方法：不同浓度雷帕霉素处理HaCaT细胞4h或12h后，利用四甲基偶

2、氮唑盐(MTr)方法检测雷帕霉素对细胞活力的影响，并提取蛋白进行蛋白印迹实验，检测LC3一Ⅱ表达水平，作为自噬的检测方法；通过透射电镜分析自噬体形成，确认雷帕霉素对自噬的诱导效果。检测自噬调控上游关键元件哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(roTOR)蛋白表达及其ser248和ser244s磷酸化产物水平，分析mTOR活性；并分析自噬调控下游的另～关键基因Atg7的表达，初步分析雷帕霉素诱导HacaT细胞的分子机制。结果：不同浓度雷帕霉素处理4h，对HaCaT细胞的活力没有显著的影响。高剂量雷帕霉素(80nmoI／

3、L和100nmol／L)在处理12h后对HaCaT细胞的活力产生毒性效应。20nmol／L和50nmol／L雷帕霉素孵育4h诱导HaCaT细胞LC3一H表达上调．而20nmol／L和50nmol／L雷帕霉素孵育12h仍具有诱导效应。相较于其他浓度，在50nmol／L雷帕霉素孵育诱导的LC3一Ⅱ表达上调效应最为显著，并且在药物孵育4h时超微结构水平诱导产生胞质内大量自噬体形成。150nmol／L浓度的雷帕霉素孵育4h或12h均可诱导HaCaT细胞roTORse-和mT0Rsep磷酸化产物水平降低；然而At

4、表达不能观测到显著的差异。结论：50nmol／L雷帕霉素孵育4h具有显著的诱导HaCaT细胞自噬效应。HaCaT细胞mTOR分子对雷帕霉素处理敏感，可被其诱导产生蛋白活化抑制效应。这种mT0R信号抑制可能参与了雷帕霉素对HacaT细胞的自噬诱导效应，但Atg7没有参与这种调控效应。[关键词】雷帕霉素；角质形成细胞；自噬【中图分类号】R751[文献标识码]A【文章编号11000—49636(2014)05—0267—05Researchonrapamycin-inducedautophagyanditsm

5、echanismsinHaCaTcellsCHENXu，XUSong，HUANGDan，JUMei，CHENKun，LIXin-yu，GUHeng(InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionCollege，Nanjing210042，China)[Abstract】0bjectives：I11eaimsofthisstudyweretoinvestigatetheeffectsofrapamycinonautoph

6、agyinhumankeatinocytecellline,HaCaTcells,anditsmolecularmechanisms．Methods：HaCaTcellsweretreatedwithdiferentconcen~ationsofrapamycinfor4or12hours．MTrassaywasusedtodetectthecellviability．Totalproteinfromcelllysiswassubjectedtowestern-blottingtodetermineth

7、eexpressionlevelsofLC3一Ⅱ．amarkerofautophagyprocess．Transmissionelectronmicroscopywasusedtoevaluatetheformationofautophagosomesandtovalidatetheinductionofautphagy．TheexpressionlevelsofphosphorylatedmTORatser2448andser2481sites,theup-streamofautophagyproce

8、ss,wereanalyzedtodeterminetheactivationofmTORInaddition,Atg7，akeyregulatorygeneofdown-steamforautophagyprocess,wasexamined．ThesepreliminaryresultswereusedtodeterminethepotentialmechanismswherebyrapamycininducesautophagyinH