细胞冻存技术.doc

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1、细胞冻存技术细胞冻存技术概述细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现匚成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一•般是指在。〜196C进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20〜40°C冰箱保存、-60〜80°C深低温冰箱和液氮(T96°C)超低温保存等。应用方向1.医学方面近年来干细胞的研

2、究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细咆和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。骨髓干细咆在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”O而“冬眠”技术对医学的发展有肴里程碑式的意义。2.生物学方面细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤

3、为关键，虽然不是治木的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。发展历史1.1776年,Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞"生命活动影响的报道。2.十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost,1840；deQuatrefages,1853；Mantegazza,1866；Scheuk,1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。3.1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。4.二十世纪50年代，Luyet等多位学

4、者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。1.1972年，Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说1=1,即冰晶损伤和溶液损伤假说。这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤叩就是冰晶损伤（Intracellularicedamage）。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随若温度的下降，细咆外部的水分会先结

5、冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时向暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在夏温时大量水分渗入细咆内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤（Solutiondamage）。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。主要技术冻存技术1.液须法日前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是足可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砍

6、1作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法乂可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。常用的细胞冷冻贮存器为液氛贮存器，规格有35L3和50L3两种。细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%〜20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜甘汕（12KC蒸气高压消毒），2ml安甑（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。主要操作步骤为：（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一•

7、天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白防消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液.用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细咆，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min,10分钟）。（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4°C预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3X106〜1X107/IU1之间。（3）将上述细胞分装于安瓶或专用冷冻槊料管中，安甑装1〜1.5ml在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭

8、，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。（4）将装好细胞的安甑或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈曰处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也