crispr-cas9基因敲除小鼠原理.doc

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1、CRISPR-CAS9基因敲除原理CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activatingRNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元

2、复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。Cas9结合gRNA，gRNA的长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA上的约60个核苷酸（gRNA长度取决于表达gRNA的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA与Cas9结合，并由此指导与DNA的结合。通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。Cas9使用简单，可满足多

3、个靶点同时操作。基因敲除小鼠流程：