CRISPR-Cas9精细原理：基因敲除、点突变、基因插入说课材料.ppt

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1、CRISPR-Cas9大全：基因敲除、点突变、基因插入2015-10-15CRISPR-Cas系统简介CRISPR-Cas系统的应用技术CRISPR-Cas系统的应用前景contents1.2CRISPR-Cas系统的结构CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以及一系列CRISPR相关蛋白基因cas。Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guideRNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是

2、它并不需要形成二聚体才能发挥作用。1.3CRISPR-CAS系统的作用机理CRISPR的高度可变的间隔区的获得首先识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM（NGG序列），将临近PAM的序列作为候选protospacer；然后在CRISPR基因座的5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个重复序列之间1.3CRISPR-CAS系统的作用机理CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)当该噬菌体再次入侵细菌时，CRISPR簇首先转录为长的crRNA前体，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。CRISPR/Cas系统活性的发挥

3、或者是对外源遗传物质的干扰crRNA结合相关的Cas蛋白后，形成crRNA-Cas蛋白复合体，通过碱基互补配对精确地与目标DNA相结合，随后Cas蛋白对目标DNA进行断裂和降解。1.3CRISPR-CAS系统的作用机理2、CRISPR-Cas系统的应用2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术基因组编辑技术是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。通过修复

4、途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因基因组编辑是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类技术成为现代分子生物学的研究热点2.1CRISPR-Cas9介导的基因组精确编辑技术CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。Mali等人利用来自酿脓链球菌和嗜热链球菌中的CRISPR相关蛋白Cas9，在一段人为重组的sgRNA(small-guideRNA)的引导下，针对小鼠和人类基因组的特定基因片段实现了精确的剪切。这种通过可编程RNA进行DN

5、A改造的技术为基因组编辑开创了一条新的途径。例子：基因敲除的实验过程1、在把基因序列中寻找NGG序列获得其附近20多个碱基的序列，与tracrRNA序列融合，设计出sgRNA并合成该序列。2、将该序列以及cas9基因连入如图所示载体。3、转化感受态，质粒小提，测序验证。4、细胞培养与细胞转染5、敲除效果检测。6、建立稳定敲除的细胞株2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活在CRISPR/Cas9的Ⅱ型系统中将Cas9中的切割域突变，会使Cas9蛋白失去对ＤＮＡ的切割活性，但不影响其与ＤＮＡ结合的能力。这种失去ＤＮＡ切割活性的

6、Cas9蛋白被命名为DeadＣas9。将ｄCas9与gRNA在细胞中共表达，则gRNA可以介导ｄCas9蛋白与ＤＮＡ结合。如果ｄCas9结合到靶基因的阅读框内，可阻断RNA聚合酶的延伸作用；如果ｄCas9结合到靶基因的启动子区域则可阻止基因转录的起始2.2CRISPR/Cas9介导的转录抑制与转录激活CRISPR／Cas9系统用于转录抑制需要PAM（３bp）和至少12bp的gRNA－ＤＮＡ配对利用crＲＮＡ介导dCas9能够精确识别靶基因的特点，将ｄCas蛋白与具有转录激活的蛋白质功能域融合则可构建具有转录激活活性的CRISPR－on系

7、统。真核细胞的转录激活因子可通过将ｄCas9与单纯疱疹病毒转录激活子ＶＰ16结合获得。3、CRISPR-Cas9技术的优势与前景3.1CRISPR-Cas9技术的优势而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复TALENs编码载体带

8、来的并发症。3.2CRISPR-Cas9系统的应用前景目前应用CRISPR-Cas9系统的研究主要集中在基因编辑方面。而Cas9真正的优势主要在于它具有能够将３种主要生物聚合物（ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白质）结合