基因工程原理与技术-5.ppt

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1、第五章聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)PCR是体外快速扩增目标DNA序列的技术1971年Khorana等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。1983年Mullis发明了PCR技术。1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术。1989年PCR被美国《Science》杂志列为十余项重大科学发明之首。1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖。应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。第一节PCR原理①遵循DNA体内复制原理，半保留式扩增；②扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有

2、效扩增长度为2kb左右；③扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段；④30~35个循环后，目标序列呈指数级扩增(2n-2)Cycle#1第二节PCR反应体系一、反应体系20μl反应体系10×buffer(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白)dNTP(各20~200μmol/L)模板DNA(0.1~2μg=105个分子)引物(各20~200pmol)MgCl2(0.5~2.5mmol/L)TaqDNA聚合酶(1~2.5U)无菌ddH2O二、反应参数预变性：94℃3~5min变性：94℃30~60S退火：38~65℃30~60S延伸：72℃1~2min终延伸：72℃10mi

3、n30~35次循环三、影响PCR的因素1、反应成分①引物；浓度、长度②DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量③dNTP；浓度、比例④Mg2+；影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。⑤反应缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。⑥模板DNA。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。2、反应条件①变性的温度和时间；热启动降低非特异性扩增②退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为Tm-5℃。退火温度越高，扩增特异性越高。③延伸温度和时间。延伸时间长短取决于

4、目标序列的长度、及延伸温度的高低。对2kb长目标序列扩增时间多采用1min(72℃时)。四、平台效应平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。引起平台效应的因素：①dNTP或引物等消耗殆尽；②酶活性逐渐降低；③最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；④非特异性产物与模板的竞争作用；⑤在高产物浓度下产物变性不完全；⑥低浓度的非特异产物开始大量扩增。PCR的特点：①灵敏度高②简便、快速③对样品纯度要求低第三节聚合酶链式反应引物设计原则一、引物设计的总原则提高特异性扩增，降低非特异性扩增。二、引物设计的一般原则①引物长度应为15~30个核苷酸，Tm接

5、近72℃较佳；Tm＝(G＋C)×4＋(A＋T)×2②引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构；③G＋C碱基的含量在45％~55％左右；④引物3’端必须与模板互补，5’端可以不互补⑤引物中连续互补碱基应小于4个；⑥引物间连续互补碱基应小于4个。三、引物3’端的末位碱基引物3’端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若为G或C，则引发率居于其间。当然，设计简并引物时，3’端末位碱基选T会得到较好的效果。四、引物设计软件Oligo6.57Primer5.0第四节PC

6、R的类型一、已知DNA序列的PCR扩增1、巢式PCR不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，引物1引物225个循环引物3引物425个循环2、热巢式PCR第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出106个细胞中的一个DNA分子。3、半巢式PCR(见下图)引物1引物225个循环25个循环引物1引物34、不对称PCR采用两种不同浓度的引物(50:1)。主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针。高浓度引物低浓度引物5、等位特异性PCR用于检测点突变。在引物的3’端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不

7、能完全阻止引物延伸。6、竞争引物PCR用于检测特定位点的点突变。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个是突变引物，而且突变碱基在引物中间，其扩增产物相差20倍以上。由于一个引物被标记，能检测出不同样品的的扩增差异。常为A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。7、降落PCR在一次PCR中，设计多循环反应的程序，第一个程序的退火温度高于Tm，以后每个程序的退火温度逐渐降低，确保第一次扩增的特异性，这样后