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1、海洋环境中微生物的分离纯化微生物学实验——2011级实验十二一、实验目的和内容目的：学习从海洋环境中分离纯化微生物及抑菌活性测定方法。内容：1.海洋环境微生物的分离纯化、培养；2.微生物培养物抑菌活性测定。二、实验原理1.海洋环境中分离纯化微生物海洋海泥中混杂着大量的微生物，利用合适的培养基，采用合适的培养条件，从里面可分离微生物。通过稀释涂布平板法、稀释倒平板法、平板划线等技术可使微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，挑取单菌落从而获得一种纯培养。2.抑菌活性测定对于一株新分离纯化出来的菌，可从各方面的活性来评价其价值：如分解淀
2、粉、分解蛋白质的活性，抑菌、抗肿瘤、杀虫等活性。本实验将对分离的微生物进行抑菌活性的测定对分离出来的菌株进行初步的功能测试。将供试菌（金黄色葡萄球菌）先接种在培养基表面，再在培养基上放置圆形滤纸片，并在纸上滴加微生物的发酵液，发酵液便向周围扩散。如果样液中含有抑制供试菌的物质（小分子或蛋白质），则供试菌生长受抑制，在滤纸片的周围形成透明圈即抑菌圈，抑菌活性越高，抑菌圈越大。三、实验仪器及材料1、仪器设备试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH1～14），培养皿，玻璃涂棒，吸管，接种环，滤纸片2、培养基3、菌种：
3、海洋土壤稀释液，金黄色葡萄球菌名称成分用途LB培养基蛋白胨1%,酵母粉0.5%,海盐3%,琼脂2%（固体）（pH=7.5）分离细菌高氏一号培养基可溶性淀粉2%,硫酸镁0.05%,硝酸钾0.1%,硫酸亚铁0.001%,海盐3%,磷酸氢二钾0.05%,琼脂2%（固体）（pH7.2~7.4）分离放线菌查氏培养基硝酸钠0.3%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,氯化钾0.05%,硫酸亚铁0.001%,蔗糖3%,海盐3%,琼脂2%（固体）（自然pH值）分离真菌四、实验步骤（一）培养基的配置1.称量药品——溶解——调节pH值（偏酸，滴加1N
4、NaOH，搅拌后，用pH试纸测其pH值，直至达到预期pH值；偏碱，用1NHCl进行调节)——分装（液体培养基直接分装，固体培养基加入2%的琼脂溶化后分装）——包扎——灭菌。2.倒置平板（培养基冷却到45~50℃）、搁置斜面（长度不超过试管总长1/2）。（二）制备土壤稀释液取海洋淤泥土样5g，放入盛有45mL无菌海盐水（3%）并带有玻璃珠的锥形瓶中，振动约20min，使土样与水充分混合，将微生物分散（10-1）。用1mL移液枪从中吸取1mL土壤悬液加入盛有9mL无菌海盐水的三角瓶中充分混匀（10-2），然后用移液枪从此试管中吸取1mL
5、加入另一个盛有9mL无菌海盐水的三角瓶中，混合均匀（10-3），类似方法制备10-4土壤悬浮液。（三）涂布平板取三种培养基平板各3个，分别标记好10-2、10-3、10-4，用移液枪分别取10-2、10-3、10-4土壤稀释液各0.1mL，对号放入相应稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒器在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min，培养基充分吸收菌液，包扎，培养。（四）培养分离纯化1.分离细菌的平板28℃培养1~2天，用接种环挑取单菌落，划入试管斜面培养基；28℃培养1~2天。2.分离放线菌的平板28℃培养5~10天，用接种环挑
6、取单菌落，划入试管斜面培养基；28℃培养5天。3.分离真菌的平板28℃培养4~10天后，用接种环挑取单菌落（由于真菌菌落扩展很快，务必及时挑菌），划入试管斜面培养基；28℃培养5天。（五）菌种的抑菌活性测定1.将分离到的菌株接种到相应的液体培养基中发酵培养：细菌发酵24h，放线菌发酵7~14天，霉菌发酵7天，直接取发酵液（样品）。2.将普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121℃，20min）。3.倒LB平板，吹干后，取100ul指示菌（本实验用金黄色葡萄球菌）过夜培养物，均匀涂布于培养基表面，吹干。4.用
7、无菌镊子夹起滤纸片放入样品（微生物发酵液）中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基上，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴；以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。5.将平板于28℃倒置培养24h后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小。A.每组需要试剂、培养基1.3%海盐水：9mL3瓶；2.培养基：名称平板试管斜面三角瓶液体共计LB培养基6个（120ml）8支（40ml）3瓶（30ml/瓶，90ml）250ml高氏一号培养基3个（60ml）8支（40ml）2瓶（30ml/瓶，60ml）200ml
8、查氏培养基3个（60ml）8支（40ml）2瓶（30ml/瓶，60ml）200mlB.任务分配第一、二组：配3%海盐水和LB培养基；第三、四组：配高氏一号培养基；第五、六组：配查氏培养基。五、实验结果与讨论1.观察描述三种培养基上菌的
