应用高分辨率熔解曲线（HRM）开发大菱鲆（Scophthalmusmaximus）SNP标记的研究.pdf

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1、第43卷第6期海洋与湖沼Vo1．43．NO．62012年11月OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICANOV一2012应用高分辨率熔解曲线(HRM)开发大菱鲆(Scophthalmusmaximus)SNP标记的研究木刘庆明，2李猛，2马爱军王新安黄智慧郭建丽(1．中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室青岛266071；2．上海海洋大学上海201306)提要利用VectorNTIAdvance11软件分析了NCBI数据库中大菱鲆的12428条ES

2、T序列，筛出候选SNP位点；应用高分辨率熔解曲线(HRM)对大菱鲆不同性状群体进行基因分型。结果表明，522个重叠群中共筛出160多个候选SNP位点；设计56对引物用于实验，能扩增出目的片段的引物有37条，合45个位点，成功率为66．1％；设计探针，能与候选SNP位点杂交的探针有13条，杂交率为28．9％。本实验中能成功进行基因分型的位点共有8个，占杂交位点的61．5％，其中有6个为碱基替换型位点，即G．A和C．T各占3个，2个为碱基颠换型位点，即T-G和A．T各占1个。关键词单核苷酸多态性标记(sNP)，大菱鲆，高分辨率熔解曲线分

3、析，EST序列中图分类号Q953大菱鲆(Scophthalmusmaximus)隶属于鲆科、菱鲆鉴定作为分子标记辅助选择(MAS)的研究(侯仕营等，属，英文名Turbot，又称“多宝鱼”，是一种欧洲沿2011；许可等，2009；HOUetal，2011)。海特有的比目鱼，属冷温性鱼类，为世界公认的优质SNP标记是基因组中最丰富的突变类型，它是鱼种(雷霁霖，2003)。目前大菱鲆已发展成为我国北遗传育种研究中的热门领域。Thomas等(2008)基于方沿海工厂化养殖业的主导品种之一(雷霁霖，2005)。EST开发了304个SNP标记，

4、构建了大西洋鲑雌性和随着养殖的发展，累代养殖和近亲交配造成种质退雄性的SNP连锁图谱。然而SNP标记的开发通常需化现象比较严重，对大菱鲆进行遗传改良，培育出具要在特定位点存在等位基因突变的已知序列信息有优质、高产、抗逆等优良性状的新品种，已成为发(Schlotterer，2004)。因此，大量的SNP标记开发通常展中亟待解决的问题(雷霁霖，2005；邹曙明等，需要花费大量的时间和金钱，特别对那些基因序列2001)。本实验室自2007年开始采用以数量遗传学为信息有限的非模式生物更是明显。目前开发大菱鲆基础的大规模家系选育技术对大菱鲆进

5、行了遗传改SNP标记的工作才刚刚起步，这一方面的研究尚未良工作，年均构建大菱鲆家系20到60个不等，对其见报道，具有很高的研究价值和广阔的研究空间。遗传参数进行分析，为大菱鲆选育工作提供必要的近年来，SNP检测方法和相关仪器的研发进展很基础依据和技术参数(马爱军等，2008，2009，2010；王快。其中，HRM是通过PCR产物的熔解曲线分析检新安等，2010)。本实验室还利用家系材料开发了大菱测PCR片段序列的微小差异的。溶解曲线的采集主鲆SSR和SNP等分子标记，目的是加强对大菱鲆遗要依靠饱和染料，如LCGreen等(Carle

6、tal，2003)。传多样性、近亲繁殖、种类和品系鉴定以及遗传连锁HRM技术主要是根据核酸分子熔解温度和熔解形状，图谱建立的研究，加快对数量性状位点(OTL)基因的通过专业的分析软件对未知样品进行区分。HRM非现代农业产业技术体系专项资-~r(CARS一50一G01)资助；国家863计划(2012AA10A408．8)资助。刘庆明，硕士研究生，E．mailliuqingming2@163．com①通讯作者：马爱军，博士，研究员，博士生导师，E-mail：maaj@ysfri．ac．cn收稿日期：2011-12．15，收修改稿日期：2

7、012．03．21海洋与湖沼43卷标记探针基因分型技术(unlabeledprobegenotyping)其它差异碱基的位点；当一种突变碱基在所在EST可以快速准确地对SNP等突变类型进行基因分型序列突变位点碱基中出现的频率大于20％以上时，(Zhouetal，2004)，该技术的基本原理与筛查未知则认为是一个候选SNP位点，可以进行下一步的检SNP的原理区别仅在于前者检测的熔解曲线是探针测和验证；候选SNP中含差异碱基reads数不应小于与目标DNA单链杂交的熔解曲线，而后者检测的是2等(张新叶等，2009；王绍宗等，2010)。

8、目的片段。由于探针长度较短，进一步提高了区分不1．2大菱鲆候选SNP的验证同样品之间的分辨率(丰贵鹏等，2OLO)。目前，利用1．2．1DNA模版的制备本实验样品来源于烟台HRM进行突变扫描的应用非常广泛，绝大多数应用天源水产有限公司