高分辨率熔解HRM的应用前景

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1、高分辨率熔解HRM的应用前景星期一，三月1st.2()101HRM技术I苏州为真生物I浏览:118摘要：高分辨率熔解(High-resolutionmelting,简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、基因分型和甲基化分析等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。高分辨率熔解(High-resolutionmelting,简称HRM)分析是一门新兴的技术。它仅仅通过pcrZJh的熔解曲线分析，就能检测pcr片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和

2、基因分型等多个方面。凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法止在迅速普及。其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收來监测的。分析需要几微克的DNA,而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达().1-1.()弋/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR®Greenh然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物屮是否存在引物二

3、聚体及其他非特杲性的扩增。如果要区分SNP,分辨率还不够。为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。SYBRGreenI就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远耒将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发卞重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。于是，饱和染料问lit了。为什么称为饱和染料呢？因为它们即便在饱和浓度(荧光最大)下，也不会抑制PCR。故高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发牛重

4、排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。IT帀j市场上的饱和染料主耍冇LCGreen.LCGreenPlus>SYTO9等几种。光有染料还不够，仪器也要和应升级呢。扩增了的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列屮如冇一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点儿摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分辨率才是高分辨率呢？根据仪器现冇的功能测试，在熔解操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最低要求。此外，温度均-•性也同样重要。如果两孔Z间温度相差0.1°C,就很町能导致最终的熔解温度相差0.1。。这样就无

5、法保证HRM分析结果的准确性。人多数常规定量PCR仪的孔间温度差在0.34.5。。这也决定了它们无法胜任HRMoH而市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包括IdahoTechnology>CorbettCQIAGEN).Roche等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功能的定量PCR仪。HRM的发明者一美国犹他大学医学院的Wittwer实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能1。他们发现，对于大部分仪器的准确基因分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异(Tm的标准偏差为().020-0.264°C)。其它差异如数据密度、信噪比和熔解速率

6、，也会影响杂合体的扫描。经过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制的仪器冇着更低的Tm标准偏差(0.018-0.065),而加热块型仪器则在0.092-0.274。在拥冇饱和染料和爲分辨率仪器Z后，HRM分析就可以开始啦。这个过程其实很简单，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从50。（2逐渐上升到95°Co在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链完全分开。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照和机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解Illi线。果然够

7、简单吧，连探针也无需设计，只要在常规PCR中加一个饱和染料即可。HRM既可以对未知突变进行筛查、扫描，也可以对已知突变进行分析。相对丁传统的突变分析而言，操作步骤人人简化，时间和成本也降低了不少。而样品经PCR扩増后直接进行HRM分析,无需转移，真正实现了闭管操作，降低了污染的风险。正是凭借这些优势，HRM近年來广泛用于突变扫描、序列配对、基因分型和甲基化分析等应用中。序列配对序列养异分析常用的方法包括单链构彖多态性、变性梯度凝胶电泳、变性高效液和色谱、测序等，这些方法都需要分离样品，Z后进行多步反应，操作繁琐，耗时长，且PCR产物冇污染的风险。而HMR在5分钟Z

8、内就能完成