高效液相色谱基础知识.doc

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1、髙效液相色谱基础知识我国药典收载高效液相色谱法项H和数量比较表:方法项n数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别934150检查1240160含量测定760117387鉴于HPLC应用在药品分析屮越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。I.概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobilephase)1P的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相屮滞留时间

2、不同，从而先后从固定相屮流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素吋发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液和色谱法，此方法柱效低、吋间长(常有儿个小吋)。高效液和色谱法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于

3、60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高床液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography,HPLC)□又因分析速度快血称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150〜300Kg/cm2o色谱柱每米降压为75Kg/cm2以上。高速流速为0.1〜1

4、0.0ml/mino高效——可达5000塔板每米。在一根柱屮同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达O.Olngo同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快——通常分析一个样站在15〜30min,有些样品甚至在5min内即可完成。分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高——紫外检测器可达O.Olng,荧光和电化学检测器可达O.lpgo柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。样殆量少，容易回收——样殆经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三

5、、色谱法分类按两和的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据同定相不同乂可分为气同色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC),其屮以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)o此外还有超临界流体色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)为流动相(常用CO2),I大I其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色

6、谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC)和亲和色谱法。(此外还有电泳。)按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液和色谱法按分离机制的不同分为液I古I吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反和)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。1.液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附一解吸附的平衡过程。常用

7、的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5〜lOum。适用于分离分子量200〜1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分2.液液色谱法离同分异构体。使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相屮溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动和的区别常引起柱子的变化；另外在流动相屮存在的同定相也使样品的分离和收集复杂化。

8、由于涂布式尚定相很难避免尚定液流失，现在己很少采用。现在多采用的是化学键合尚定相，如C]8、Cg、氨基柱、氤基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法（NPC）和反相色谱法（RPC）o正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腊基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷坯类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异内•醇、四氢吠喃、三氯甲烷等以调节组