细菌内毒素检查规程.doc

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1、细菌内毒素检查规程一、目的：阐述细菌内毒素检查规程。二、适用范围：适用于细菌内毒素的检查规程。三、责任者：品控部。四、正文：1简述1.1本规程适用于2005年版附录中细菌内毒素检查法——凝胶法1.2鲎试剂灵敏度复核试验的目的不仅是考查鲎试剂和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确和实验条件是否符合规定。因此要求每个实验室在将一批新的鲎试剂用于干扰试验或供试品细菌内毒素检查前应进行鲎试剂灵敏度复核试验。1.3供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和工艺是否有变化，鲎试剂来源于不同或供试品阳性

2、对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。1.4检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。2实验材料及用具2.1天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。2.2电热干燥箱除外源性内毒用，温度应能维护250℃以上至少一小时。2.3恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37°±1℃保持一小时。2.4水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。2.5旋涡混合器2.6鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号2.7细菌内毒素国家标准品（NSE），细菌内毒素工作标准品（WSE），除另有规定外应由中国药品生

3、物制品检定所统一发放。2.8细菌内毒素检查用水（BET水）系指与灵敏度为0.03Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37±1℃条件下不产生凝集反应的灭菌注射用水。2.9实验用具移液管（或刻度吸管，定量移液器）、凝集管（10×75mm）、三角瓶、小试管（16×100mm）、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管架、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮。所用玻璃器皿经过250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。2.10试剂75%乙醇、蒸馏水、铬酸洗液3操作方法3.1试验准备3.1.1洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。3.

4、1.2玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。3.1.3除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250℃，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周内使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性内毒素。3.2鲎试剂灵敏度复核3.2.1内毒素标准溶液的制备3.2.1.1取NSE或WSE一

5、支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。3.2.1.2按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌内毒素标准溶液即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ(λ为所复核鲎试剂的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒(详细过程请参见使用说明书)。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。例如使用NSE(内毒素含量为9000EU/支)时的方法如下：复溶：准确吸取BET水

6、1ml加入NSE的安部内，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml内毒素标准溶液。稀释：取0.3ml→10稀释液，加上2.7mlBET水即为1→10稀释液，得到900EU/ml内毒素标准溶液。取0.3ml1→10稀释液，加上2.7mlBET水即为1→100稀释液，得到90EU/ml内毒素标准溶液。往后依次类推。也可写成下列格式：0.3ml0.3ml0.3ml0.3ml1ml1ml9000EU/ml→900EU/ml→90EU/mll→90EU/mll→1EU/ml→0.5EU/ml→2.7ml2.7ml2.7ml2.

7、4ml1ml1ml1ml1ml1ml0.25EU/ml→0.125EU/ml→0.0625EU/ml→0.03125EU/ml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。3.2.2待复核鲎试剂的准备3.2.2.1在制备内毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内，加入0.1mlBET水复溶，使内容物充分溶解，避免产生气泡。3.2.2.2若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混

8、匀后每0.1ml分配到10×75mm凝聚管中，要求至少分配18管备用。3.2.3加样3.2.3.1将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，