HBV DNA荧光定量PCR技术.doc

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1、一、HBVDNA荧光定量PCR技术（一）标本血清、血浆（其它如组织细胞、乳汁、精子、尿液等体液）；标本应封闭保存，特别在夏季，如果标本暴露的过久，开盖保存，很容易出现水分蒸发，检测结果和上一次的检测结果会有较大的差异。环境条件影响不大，比如保存在-8°、-20°、24°、还是室温，对高中低病毒含量的最后的检测结果影响不是太大，只要封闭保存就可以。因此可常温运输，但不可泄露。（二）检测方法国内最常使用PEG（聚乙二醇方法）法进行核酸提取，采用TaqMan探针进行荧光PCR扩增。扩增40循环进行结果分析，如下图一所示：典型的双S形的曲线图，越早出现荧光曲线的病

2、毒含量越高，越晚越低。根据不同的梯度的四个标准品进行定量。如果血清或标本里面没有病毒，就是一个阴性直线。最近我们在彻底解决污染问题之后采用扩增50个循环的方法。优点是让扩增管里的反应液充分反应，缺点是如果实验室存在一个潜在的污染或操作人员操作习惯不好，很容易出现携带污染，造成假阳性。对实验室的来说不应该通过减少扩增的循环数来解决污染问题，而应该通过科学的管理，提高试剂的质量，以及养成一个良好的操作习惯，或防污染的习惯来解决假阳性的问题。增加循环数有利于标本检测结果的判断，这将来可能是实验室发展的一个趋向。COBASTaqMan技术在我们国家已经有好多实验室

3、有这种全自动的核酸提取扩增系统，它的优势重点在于检测病毒含量比较低的血清标本，但是对于病毒含量比较高的，往往出现荧光PCR竞争的缺点。图一为：PCR扩增曲线（三）污染的预防与排除PCR扩增产物污染是PCR反应中最主要最常见的污染问题，所以扩增区的仪器如枪头等要注意。最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩增区

4、，包括反应液的配制和PCR扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增→产物分析→产物处理。切记:产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染。（四）常用仪器常用的PCR仪器：ABI系列、罗氏系列、安捷伦系列、国产SLAN等。（五）临床意义检测血清或血浆HBVDNA阳性有什么临床意义？1.判断血清中是否有HBVDNA的存在我们检测到的HBVDNA包括完整HBV病毒和DN

5、A片段。目前我们用的HBVDNA荧光PCR法，还不能区分是完整病毒还是片段。只要检测到的病毒载量在检测线以上就可以定为标本含有HBVDNA。2.判断抗病毒疗效的评估指标细胞内HBVDNA和HBVDNA确认方法。病人采用各种抗病毒药物，比如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦或替米夫定等抗病毒药物，因为这些药可以有效的抑制病毒复制，用药之前或用药之后，病人的血清里或外周血白细胞里是不是还有病毒的存在？病毒下降了多少？是不是有病毒的反弹？这是临床医生关心的问题。随着抗病毒药物用药时间的延长，有些病人血清里面的HBVDNA一直处于检测线以下。因此目前临床医生有一些新的需

6、求，就是能不能确认病人血清里究竟有没有HBVDNA。不同的实验室报告检测低限值不一样，有的实验室报<1000IU，有的实验室报<100IU，COBASTaqMan<12个，<12个还是有病毒，血清里究竟有多少个？是临床急需的一种HBVDNA确认方法。即确认血清里面究竟有没有病毒。现在已经提出一种检测方法。3.HBVDNA阳性与传染性感染乙肝病毒必须达到一定的量，突破各种屏障（血液里的补体、细胞因子、抗体等），进入肝细胞复制，才能达到传染性的要求，因此并不是接触到病毒都会被感染。HBeAg的产生与意义→HBeAg与HBVDNA清除的不平衡带来的异常模式→HB

7、sAg的包裹与剪切（完整HBV形成）→不同形式HBsAg的产生与意义。抗HBc、抗HBe和抗HBs的产生。四，HBVDNA定量与乙肝血清学模式不同组合的意义。大三阳（表面抗原、E抗原和核心抗体阳性）并抗HBs阳性：HBsAg/IgM。E抗原阳性说明病人体内的乙肝病毒处于一种活跃性的复制状态。这时有的病人合并表面抗体的阳性，是不是获得一定的抵抗力？不是。表面抗体往往是病毒复制时诱发了机体免疫答应而产生相应的抗体，这个抗体是针对表面抗原的IgM大蛋白抗体。因此它是机体对乙肝病毒复制免疫反抗的结果。这时要提高病人或保持病人的免疫功能；小三阳并抗HBs阳性：病毒活

8、动性复制、不同型病毒的感染等；抗HBs或抗HBc与HBVDNA同时