IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤.doc

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1、IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与

2、P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料(1)LB（Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeastextract)5g蛋白胨(Peptone)10gNaCl10g琼脂(Agar)1-2%蒸馏水(Distilledwater)1000mlpH7

3、.0适用范围：大肠杆菌(2)IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，－20℃保存。(3)l×凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS（电泳级）0.1％溴酚蓝10％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1）酶溶法（1）裂解缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI（2）50mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）。（3）10mg/mL溶菌酶。（4）脱氧胆酸。（5）1mg/mLDNaseI。2）超声破碎法(1)TE缓冲液。(

4、2)2×SDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2％溴酚蓝20％甘油实验方案1、外源基因的诱导表达(1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。(2）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。(3）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行下一步。(4）如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37

5、℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L。继续培养3-5h。(5）取上述培养液1mL,1000g离心，1min，沉淀，加100μL聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS-PAGE检测。2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1）细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3-葡聚糖酶；β-1,6-葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主

6、要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为：①4℃，5000rpm离心，15min，收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。