IPTG诱导表达方案和注意.doc

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1、实验方案1、外源基因的诱导表达（1）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因。（2）按连接步骤连接日的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。（3）筛选出含重组子的转化菌落，捉取质粒DNA作限制性内切核酸酶图谱，DNA序列测定，确定无谋后进行下一步。（4）如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30・32r培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6,迅速使温度升至429继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则379培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为lmmol/Lo继续培养3-5ho（5）取上述培养液1mLz1000g离心,lmin，沉淀，加100

2、"聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS-PAGE检测。2、人肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1）细菌的裂解常用方法有：%1高温珠磨法；%1高压匀浆；%1超声破碎法；%1酶溶法；%1化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在丁•业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。（1）酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;P-1,3-葡聚糖酶;p-lz6-«J聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他儿种酶对酵母作用显著。主要步骤为：①4°C,5000rpm离心，15min,收集诱导表达的细菌培养液（100mL）。弃

3、上清，约每克湿菌加3mL裂解缓冲液，悬浮沉淀。E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖甘酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列0、-•个启动序列P及一个调节基因I（图15-4）oI基因编码一种阻遏蛋H，后者与0序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活馥白（CAP）结合位点。由P序列、0序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与0序列

4、结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系屮，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b—半乳糖甘酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋片与0序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖甘（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料(1)LB(Luria—Bertani))培养基酵母膏(Yeastextract)5g蛋白(Peptone)10gNaCIlOg琼脂(Agar)1-2%蒸憾水(Distilledwater

5、)1000mlpH7.0适用范围：人肠杆菌(2)IPTG贮备液：2glPTG溶于10mL蒸啊水屮，0.22pm滤膜过滤除菌，分装成1mL/份，一20°C保存。(3)lx凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris-Cl(pH6.8)50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0.1%漠酚蓝10%甘汕2、人肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1)酶溶法(1)裂解缓冲液：50mmol/LTris-CI(pH8.0)1mmol/LEDTA100mmol/LNaCI(2)50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。⑶10mg/mL溶菌酶。(4)脱氧服酸。(5)1mg/mLDNaseI。2)超声破碎法(1

6、)TE缓冲液。(2)2xSDS-PAGE凝胶电泳加样缓冲液：100mmol/LTris-HCI(pH8.0)100mmol/LDTT4%SDS0.2%漠酚蓝20%甘油