HIV核酸检测技术2014.ppt

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1、HIV核酸检测及婴幼儿诊断HIV核酸检测的意义早期诊断婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险度”，减少二代传播。疑难样本的辅助诊断在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV

2、抗体检测结果不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。遗传变异监测可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测耐药性监测可用于HIV耐药检测和监测，指导公共卫生医生了解耐药性病毒株流行的态势和指导临床医生判断抗病毒治

3、疗效果和修改抗病毒治疗方案。病程监控及预测HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案指导抗病毒治疗及疗效判定通常在病毒载量达到一定水平后（如>35，000～50，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。样本采集原则样品恰当的采集、保存和运送是所有检测需要考虑的很重要的一部分。样品的采集和保存时，要使用无菌技术，包

4、括消毒管、吸头和试剂及工作环境都要防止样品污染。样品的采集艾滋病检测最常用的样品是血液，包括血清、血浆和全血。病毒载量通常不使用全血。血清的检测结果大约是血浆的50％（30～80％），可能是因为HIV病毒颗粒被包裹在纤维蛋白网络中血浆中RNA量比血清中高并稳定。全血中病毒载量非常不稳定。EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本低15％)采集的样品应在4～8小时以内分离血浆。样品的保存用于核酸检测的血浆和血细胞样品应冻存于－20℃以下，进行病毒RNA检测的

5、样品如长期（3个月以上）保存应置于－80℃或液氮里。样品的运送病毒载量测定的样品应为血浆，样品应置于带螺旋盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的编号或受检者姓名、种类和采集时间。随样品应附有送检单，送检单应与标本分开，不能混放。在冷冻条件下运送，每一包装的体积不得超过50ml。实验室设置原则明确实验室的设置原则和工作流程设计，最终目的是为避免实验室污染。明确实验室设置和工作流程中好的和不好的实例。明确我们当前实验室设置中，为避免实验室污染有必要进行的整改。要点：各区必须是相互独立的，有条件各区内分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终

6、完全分开。各区的仪器设备以及各种物品必须专用。试剂准备区和样品处理区科保持低度正压或常压，是空气始终由室内流向室外，以避免扩增物进入此区。扩增产物分析区保持低度负压，可安装排风扇或其他排风装置。也可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向进行，工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。三实验

7、室布局实例(备选1)实验室2实验室3“扩增后"Lab电泳分析、测序反应和毛细管电泳实验室1“样品处理"Lab样品接受储存MastermixpreparationRNA提取和第一轮PCR反应混合“扩增"Lab第一轮扩增2ndroundPCRset-up第二轮扩增在密闭箱中以专用加样器操作样品FrozenplasmaWholebloodDBS13PCR工作站(Dead-airCabinets)15三实验室布局(备选2A)实验室2“样品处理和PCR"Lab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合样品FrozenplasmaWholebloodD

8、BS1stroundamplification2ndroundPCRset-up实验室1“无模板"Lab试剂储存主反应混合物制备实验室3“扩增后"Lab第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳在密闭箱中以