PCR实验室检测技术.ppt

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1、PCR实验室检测技术宁夏动物疾病预防控制中心2011.08.04PCR检测技术一、PCR技术原理DNA在细胞中的复制是—个比较复杂的过程。参与复制的基本因素有：DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA模板、由引发酶合成的RNA引物、核苷酸原料、无机离子、合适的pH、以及解开DNA的超螺旋及双螺旋等结构的若干酶与蛋白质因子等。PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火)、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复

2、制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下一般都可见到DNA的特异扩增条带。二、PCR技术工作流程及注意事项（一）PCR实验室的布局PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，这也是最容易造成假阳性原因之一。实验室布局应重点考虑避免这种污染。因此用于PCR检测的实验室要进行功能区域划分，从对环境要求的严格程度和功能上可将PCR整个实验流程划分为四个区域：1.配液区（准备区）2.模板提取区3.PCR扩增区4.电

3、泳区（二）各区操作注意事项下述操作在该区进行：储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验室及其设备的使用必须有日常记录。1.配液区（准备区）2.模板制备区下述操作在该区进行：标本保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理

4、和灭活程序。样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法。3.扩增区下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。4.电泳区下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区

5、扩散至前面区域的可能性。（三）PCR实验室设置的原则注意：唯一流向制度问题：要求物流、人流均应严格遵守1→2→3→4路线，严禁倒流。物品的专用与移动问题：移液器、吸头和离心管等为PCR专用，各区之间勿串用三、PCR操作程序一是PCR扩增模板的制备，也就是病原微生物基因组提取二是PCR扩增，即目的基因特异扩增过程三是琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯下检测基因片段*PCR模板的提取（一）样品的采集及前处理活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取

6、粪便。然后将拭子一起放入盛有2mlPBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。组织脏器，取待检样品0.05g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加2mlPBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。血清、血浆、乳汁、精液或组织渗出液，则直接取用。（二）提取模板提取病原微生物基因组是PCR操作成功关键的一步，特别是病原RNA的提取显得非常重要。一般分为两步：1.裂解病原微生物，使病原基因组从病原体溢出。2.纯化病原基因组，去除蛋白质和一些盐类。（三）病原微生物基因组提取注意事项1.RNA提

7、取应注意RNA酶（RNase）污染问题，RNase是一种不怕热和不易降解的蛋白质，而且广泛存在于我们工作环境中，对于此酶污染的防治办法主要有两方面：①在提取RAN试剂中加入一些RNase抑制剂②操作过程中保持环境干净、密闭、戴口罩手套操作等。2.在病原微生物基因组提取时，由于是微量，几乎看不见。所以当离心机离心沉淀RNA和DNA时要记住离心管方向，加入乙醇洗沉淀时要缓慢加入，避免冲掉已提取出来的模板。溶解沉淀时要沿着沉淀部位进行溶解。3.在病原微生物基因组提取时，应注意实验室环境污染和操作人员安全防护。（四）实验器材必须

8、使用PCR专用吸头试剂盒的运输和贮存PCR试剂盒在适当的贮存温度下的有效期一般为6个月核酸扩增部分的试剂一般要贮存于-20℃产物检测部分试剂则贮存于2～8℃。*PCR扩增（一）PCR反应体系组成①PCR缓冲液(含Mg2＋)②模板③4种dNTP④引物⑤Taq酶（二）PCR扩增程序：扩增程序实际上是一个3种不同温度的热循