SNP分子标记的原理及应用解析.ppt

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1、、SNP分子标记的原理及应用SNP的概念单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism，SNP)，指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。它包括单碱基的转换,颠换、插入及缺失等形式。SNP的特点（1）密度高SNP在人类基因组的平均密度估计为11000bp,在整个基因组的分布达3×106个。（2）富有代表性某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平,因此,它们可能

2、代表疾病遗传机理中的某些作用因素。（3）遗传稳定性与微卫星等重复序列多态性标记相比,SNP具有更高的遗传稳定性。（4）易实现分析的自动化SNP标记在人群中只有两种等位型(allele)。这样在检测时只需一个“+-”或“全无”的方式,这使得基于SNP的检测分析方法易实现自动化。种族遗传学Tang等研究了来自世界五个地区(中国、马来、高加索、印度和非洲)人群的MDR1基因的单倍体和连锁不平衡特征,发现具有e12/1236T2e21/2677T2e26/3435T亚型的单倍型mh5在非洲人群以外的四种人群中高度表达,而具有e

3、12/1236C2e21/2677G2e26/3435C亚型的单倍型mh7在非洲人群中占了1/3以上,进一步证明了种族间的表形差异。SNP的应用疾病易感性研究原理：SNPs被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过非患者时,即表明该标记与疾病关联,通过比较分析两者的单倍型和研究连锁不平衡性,可将基因组中任何未知的致病基因定位。Horikawa等应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不平衡的相关分析,在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现了一个DM易感基因,该基因第三个内含子上的A/

4、G多态性(SNP43)同2型糖尿病(2型DM)连锁,该位点为纯合子G的个体患2型DM的风险增加,这是目前为止所发现的第一个与2型DM相关的SNP,预示了SNP在DM相关基因研究中的重要作用。药物基因组学研究SNPs可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs位点与个体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择合适的受试者,提高效率,减少费用。遗传育种的应用检测水稻SNP，研究优良性状

5、与SNPs的关联关系，指导育种。SNP的检测方法基于以下9种基本原理:以结构为基础;1.1限制性片段长度多态性法（RFLP）;1.2单链构象多态性法（SSCP）;1.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）;等位基因特异PCR（AS-PCR）;RT-PCR;等位基因特异性杂交;引物延伸法--单碱基延伸法;DNA直接测序法;飞行质谱仪(MALDI-TOFMS)检测;变性高效液相色谱(DHPLC)法；1.1RFLP法原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存在SNP位点，酶切片断

6、的长度和数量则会出现差异，根据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。1.2单链构象多态性(SSCP)原理：单链DNA在中性条件下会形成二级结构，不同的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体位

7、置。1.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）原理：是利用长度相同的双链DNA片段解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开的电泳技术。2.等位基因特异PCR(AS-PCR)原理：根据SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与SNP位点的碱基互补(或相同),另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩增产物的有无,从而确定基因型的SNP。3.RT-PCR实时荧光PC

8、R技术(RT-PCR)一种通过检测PCR过程中和PCR之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP检测技术,同时基于荧光能量转移原理(FRET)。每检测一个SNP位点需要一条探针,其3‘端连有淬灭剂基团,5’端连有荧光剂基团,最终与SNP位点完全匹配时探针结构被破坏,从而发出荧光而被检测。定量分析高灵敏