初稿分子标记技术.ppt

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1、四种分子标记技术在寄生虫分类鉴定上的应用汇报人：舒凡帆汇报内容1.RAPD:随机扩增多态DNA2.AFLP：扩增片段长度多态性3.SSCP：单链构象多态性原理4.STRsorSSRs：微卫星RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）1990年William等和Welsh等在两个实验室同时报道了一种新的DNA指纹方法分别取名为RAPD和随意引物PCR。RAPD原理一条随即寡核苷酸引物（10bp）对总DNA进行PCR扩增，引物虽随即，但在总DNA上总会有特定位点。1级位点次级位点无效位点R

2、APD原理如果2个一级位点位于一条DNA链2条互补链上，呈方向重复序列，且长度小于2kb，便能扩增。不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。RAPD原理RAPD技术与PCR技术区别引物可随机合成和随机选定，长度一般为9-10个核苷酸；随机扩增引物是单个加入，而不是成对(正、反向引物)加入。其次，随机引物短，由于随机引物较短，退火温度较低，一般为35-45℃。RAP

3、D优点引物的随机性引物的通用性极大的探测性：可以在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行DNA多态性分析高效性：可在短期内获得大量的多态性DNA片段，能反映整个基因组的变化技术简单，容易掌握，不需要复杂的准备工作RAPD缺点稳定性差，由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次得到的实验结果不可能一致高度的变异性，即使亲缘关系非常近的物种问结果也有很大差异解链温度低的随机引物，易受到外界条件影响AFLP分子标记技术原理1：不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大

4、小不同的限制性片段。2：对基因组酶切片段的选择性扩增，将获得的扩增片段通过电泳分离检测，根据带型中一些特征条带的出现或消失，检测出不同扩增片段长度的多态性。AFLP分子标记技术方法1:使用两种不同的限制性内切酶对整个基因组DNA进行酶切反应.2：将所得的两端具有不同黏性末端的酶切片段与特异的人工接头在T4连接酶作用下进行连接，用作PCR扩增反应的模板。3：用带有选择性碱基的特异引物对模板进行PCR选择性扩增，用于PCR扩增的引物的不同决定了哪些片段能够被扩增。4：为使得扩增效果更好，反应一般分两步进行，即预扩增和

5、选择性扩增5：最后将获得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳．再经EB染色或银染后，清晰呈现片段长度的多态性。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(coresequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specificsequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selectiveextension，EXT)。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板.用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了

6、扩增片段的特殊性.只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增.扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性.AFLP优点AFLP结合了RFLP的稳定性及PCR的敏感性不需要事先知道DNA序列资料;稳定可靠;可用于任何来源或复杂的目的DNA。为什么要检测突变1，是为弄懂人类遗传性疾病分子机制，以便有效的预防，诊断和治疗，但是更多的是用于分析不同生物基因型与表型的关联2，对于野生型与突变体总DNA序列分析费时，昂贵，所以应该先扫描，在

7、测序。SSCP:单链构象多态性原理此法的原理是:在非变性凝胶基质中,单股DNA分子的电泳迁移率取决于其结构(构象)及大小.由于核苷酸之间的碱基配对,使单股DNA分子发生二级及三级构象,这些构象取决于单股DNA分子的长度、碱基组成、碱基配对区的位置及数量在最佳条件下,即使在某一特定位置的一个碱基变化亦可改变分子构象,从而导致电泳受排阻大小不同不同迁移率的单股DNA带可从电泳胶上切或进行PCR再扩增并测序,以确定核苷酸变异。和正常电泳图片的对比，寻找突变。单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，使

8、构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.SSCP方法取阳性PCR产物10微升．加等量的载样缓冲液(95%甲酰胺、2Ommol／IEDTA、0．03%二甲苯蓝、0．05%溴酚蓝)．94℃变性5min后立即置于冰盒中2min复性。形成一定空间结构的单