SDS法提取植物基因组DNA.doc

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1、SDS法提取植物基因组DNA【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作；2.获得高纯度、完整DNA样品。一、原理：利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。二、药品试剂及耗材：

2、——液氮——提取缓冲液：500mmol/LNaCl,100mmol/LTris-HClph8,50mmol/LEDTAph8，10mmol/L2-巯基乙醇（用前加入）----20%SDSph7.2----5mol/LKAc----氯仿：异戊醇（24：1）——异丙醇——70%乙醇——TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,PH8.0耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪

3、刀三、操作程序1.将1g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2ml离心管中。2.加入1.2ml预热至65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。3.加入0.45ml5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000rpm离心20min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。4.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000rpm离心15min。5.

4、转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20℃放置30分钟沉淀核酸。6.25℃，12000rpm，离心10min，收集沉淀。7.弃上清，70％乙醇洗两次。1.凉干DNA，溶于50µlddH2O（或TEbiffer），4℃保存备用。各药剂作用：平衡酚（Tris饱和）：用Tris碱饱和的苯酚，其作用是去除蛋白质重提缓冲液：10mmol/LTris-HCl（pH8.0） 有机合成的中间体；           0.1mol/L EDTA （pH8.0）  螯合溶液中的金属离

5、子（Ca2+）；0.5%        SDS           阴离子表面活性剂；氯仿：抑制核酸酶，提苯酚；异戊醇：异戊醇可快速分层，去气泡；异丙醇：能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA的水分子，使DNA沉淀。可常温沉淀，离心，加入体积为0.5—0.7V，但，不易除去，故用70%酒精多洗几次，否则对酶切，连接有影响。无水乙醇：易于从DNA沉淀中除去。但-20℃放置10~30min，离心T：4℃，加入沉淀剂体积大（2倍），由于使用的管多为一次性，故浪费。蛋白酶K（ProteinaseK）：无RNA酶和DNA酶

6、活性，有降解天然蛋白质的能力；RNA酶：分解RNA。要点1：某些植物种的DNA由于褐色多酚类化合物的存在会出现变色现象，这种变色通常不会影响后续的实验操作。但如果发现有影响的话，可以在一定量的2-巯基乙醇，防止酚氧化，对DNA有一定稳定作用。或在提取缓冲液中加入2%（W/V）的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），与酚类结合，有助于除去多酚类杂质。要点2：将SDS溶液加入到化冻的提取物中时，可能会有沉淀析出，要保证析出的SDS重新溶解，以及65℃保温时提取物混匀。要点3：在高浓度（>1mol/L）的钾离子存在的情况下,十二

7、烷基磺酸钠(SDS)会与蛋白或多糖结合变成不溶性的十二烷磺酸钾复合物,这类复合物通常呈絮状,必须要经较高转速离心和Miracloth纱布过滤予以去除.要点4：若沉淀难于重新溶解,可在65℃加热10min.