生化技术自我整理.doc

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1、一、生命大分子制备1、生物大分子的特征：（1）由结构比较简单的小分子所组成（2）具有非常复杂的结构2、生物大分子制备难度：（1）生物材料的组成极其复杂（2）许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程又长（3）许多生物大分子极易失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件（4）溶液的温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子的制备，很难准确估计和判断，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。3、生物大分子制备的通常步骤：（1）确定要制备的生物大分子的目的和要求（2）建立相应的可靠的分析测定方法（3）通过文献调研和预

2、备性实验，掌握生物大分子的物理化学性质（4）生物材料的破碎和预处理（5）分离纯化方案的选择和探索（6）生物大分子制备物的纯度的鉴定。要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰（7）产物的浓缩，干燥和保存4、蛋白质的分离纯化：（1）材料获得：天然获得；基因工程手段获得（2）粗分离：除去大量杂质和杂蛋白，初步浓缩目的蛋白（3）细分离：常压柱层析：分子筛层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析（4）鉴定：纯度、浓度、活性5、蛋白质的结构研究：（1）一级结构：氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析（2）二级结构：紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性

3、法、红外光谱法、激光拉曼光谱法（3）高级结构：X-射线衍射法、核磁共振法（4）结构与功能的关系：突变、晶体分析、蛋白与蛋白的相互作用6、酶活力：酶催化一定化学反应的能力。7、酶活力单位：每分钟催化生成一微摩尔产生所需要的酶量为一个酶活力单位。8、制备生物大分子的方法：（1）以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等（2）以溶解度的差异为依据的方法：盐析。萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等（3）以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等（4）以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等9、酶的比活

4、力：每毫克酶蛋白所含有的酶活力单位娄，是酶制剂纯度的一个指标10、回收率：纯化过程中酶活性的收率11、纯化位数：指提纯后与提纯前酶比活力的比值增大纯化位数和缓慢降低回收率的方法属于有应用价值的方法。12、蛋白质的鉴定：（1）浓度：紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法（2）纯度：电泳法、化学法、仪器法（3）分子量测定：SDS-PAGE、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳（4）等电点：等电聚焦电泳（5）活性：激酶、磷酸化酶、利用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。二、沉淀法1、沉淀法：纯化大分子物质的一种经典方法。操作简单，成本低廉。不仅

5、用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程，可以有选择性的沉淀杂质或有效成分。原理：不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的(又称溶解度法)改变溶液的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中各种物质的溶解度发生变化。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反，有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。然后经过适当处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的。2、沉淀可以分为可逆性沉淀和不可逆性沉

6、淀可逆性沉淀：在沉淀过程中，有效成分结构和性质都没发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化有效成分的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀物不可能再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。（沉淀物一般是杂质）3、常用的沉淀方法和沉淀剂：（1）盐析法：选用中性盐为沉淀剂，多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。（2）有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子，多糖及核酸类产品的分离纯化，有时

7、也用于蛋白质沉淀。（3）等电点沉淀法：用于氨基酸，蛋白质及其他两性物质的沉淀，但单独应用较少，多与其他方法结合使用。4、制备蛋白质：（1）盐析法：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。1-1．优点：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏

8、水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶