鸡卵类粘蛋白提取.doc

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1、.鸡卵类粘蛋白提取摘要：本实验利用蛋白质在等电点处会沉淀和丙酮分级沉淀的特征，对样品进行粗处理。在对处理过的样品进行细分离，其方法是凝胶过滤。最后通过SDS—PAGE电泳对粗样品进行细分离和对样品的分子量进行分析。有实验可得鸡卵类粘蛋白的分子质量为32187Da。关键词：鸡卵类粘蛋白，凝胶过滤，SDS—PAGE第一章前言1.1鸡卵类粘蛋白的介绍鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，它具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用与胰蛋白酶的酶学性质的研究。也可将其制成吸附亲合剂，通过亲和层析技术有效分离与纯化胰蛋白酶。鸡卵类粘蛋

2、白是至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常呈现不均一性。目前至少已经获得4种不同组分，它们在抑制胰蛋白酶的性质上和氨基酸的组成上没有多大区别，但是在糖蛋白的糖蛋白部分（主要是D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖胺和唾液酸）的含量上有差别。它们的等电点有一定的围，是在pH3.9-4.5。相对分子量28000。鸡卵类粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高溶度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其当温度比较高时迅速失活。鸡卵类粘蛋白除对猪和牛的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定程度上的抑制作用，但对

3、胰凝乳蛋白酶无抑制作用，另外对人的胰蛋白酶也无明显的抑制作用。1.2对样品前处理的原理先由鸡蛋清经三氯乙酸（TCA）-丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品，经分离从而获得粗品。1.3凝胶过滤的原理Word资料.凝胶过滤也称为排阻层析，分子筛层析和凝胶层析。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其部具有许多细微的多孔网状结构。凝胶层析的机理是分子筛效应，当凝胶颗粒在合适的溶剂中浸泡，充分吸液膨胀，然后转入到层析柱，加入欲分离的混合物，再以同一洗脱液洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶部而在凝胶颗粒的空隙最先

4、流出柱外，而小分子物质可以进入凝胶颗粒的部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质按照顺序分离开。1.1SDS-PAGE测定鸡卵类粘蛋白的分子量SDS-PAGE是在要将进行电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即为十二烷基磺酸钠，是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水中处理3-5min，使SDS与蛋白质

5、充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质-蛋白质复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。有上述可以知道，在SDS-PAGE电泳中蛋白质就按分子量的大小分离出来。第一章鸡卵类粘蛋白的粗提取2.1试剂与仪器试剂：鸡蛋，丙酮，TCA-丙酮：34.5g三氯乙酸溶于38.3ml蒸馏水，再加入100.5ml丙酮配成150mlTCA-丙酮

6、溶液，5mol/LNaOH，5mol/LHCl。仪器：低速离心机和高速冷冻离心机，水浴锅，真空干燥仪。2.2实验步骤1.取一只鸡蛋，先讲蛋的一端开一个小洞，然后将蛋放在100ml量筒上，再将蛋的另一端也开一个小洞，蛋清就会流入100ml量筒的里，取45ml蛋清倒入100ml小烧杯里。2.25-30℃水浴下不断搅拌，慢慢加入等体积TCA-丙酮溶液，此时其pH约为1.5。用5mol/LNaOH将pH调至3.5，调至3.5后，继续搅拌30min。4℃静止80min，3000rpm离心30min，取上清。边搅拌上清加入4倍体积的

7、预冷的丙酮，4℃静止80min，掉到部分上清，3000rpm离心15min，取沉淀真空干燥。第二章凝胶过滤层析法纯化鸡卵类粘蛋白3.1试剂与仪器试剂：葡聚糖凝胶G-100，pH6.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）。Word资料.仪器：电子天平，离心机，柱层析系统：层析柱，核酸蛋白检测仪，部分收集器，微量泵，记录仪。3.2实验步骤1.装柱：装柱前，必须用真空干燥器抽空凝胶中的空气，并将凝胶上面的多余的水倒掉，并且柱子底部要留一点水。2.平衡：用pH6.5的0.02mol/LPBS平衡柱子，平衡是的流速为0.7-

8、0.8ml/min。平衡要充分，否则会影响分离效果。3.样品处理：取鸡卵类粘蛋白粗制品60-80mg，放入10ml试管中，用0.7ml的PBS溶解，用玻璃棒搅匀后，转移至1.5ml小离心管中，3000rpm离心5min，取上清为样品。4.上样：把样品加入到层析柱中。5.洗脱：用PBS进行洗脱，用蓝色葡聚糖和铬酸钾来测