行业标准：T∕CVMA 8-2018 动物A型流感病毒微滴式数字R∕T-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准MAT/CVMA8—2018动物A型流感病毒微滴式数字RT-PCR检测方法MethodofdropletdigitalRT-PCRfordetectionofinfluenzaAvirus2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA8—2018前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、杨林、周锦萍、宋晓晖、辛盛鹏、原霖、鞠厚斌、董浩、顾小雪、杨德全、徐琦、亢文华、汪葆玥、马英、王晓英

2、、陈亚娜。IT/CVMA8—2018动物A型流感病毒微滴式数字RT-PCR检测方法1范围本标准规定了动物A型流感病毒（InfluenzaAVirus）微滴式数字RT-PCR检测方法的试剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析。本标准适用于动物A型流感病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3原理微滴式数字PCR（DropletDigitalPCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份反应

3、体系分成数万个纳升级的微滴进行定量PCR检测，本质上是将传统定量PCR的一次检测变成数万次检测，提高了检测的灵敏度和精准度。微滴发生器可以将每一份扩增体系分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都将作为一个独立的PCR扩增体系，在PCR扩增仪上进行终点PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。4试剂与耗材4.1提取试剂宜选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。4.2微滴式数字RT-PCR扩增试剂宜按照不同的微滴式数字PCR

4、平台的说明书选取推荐的微滴式数字RT-PCR扩增试剂。4.3引物和探针AIV上游引物（Flu-A-F）：5＇-AGATGAKTCTTCTAACCGAGGTCG-3＇AIV下游引物（Flu-A-R）：5＇-TGCAAAGACATCTTCDAGTCTCTG-3＇1T/CVMA8—2018AIV探针（Flu-A-P）：5＇-FAM-TCASGCCCCCTCVAAGCCGA-BHQ1-3＇5仪器与设备生物安全柜、PCR扩增仪、数字PCR微滴发生器、数字PCR微滴分析仪、纯水仪、核酸定量仪、涡旋震荡仪。6操作步骤6.1样品采集及运输按照NY/T541执行。6.2RNA提取按照所选取的病毒RNA提取试

5、剂盒说明书进行提取。6.3微滴式数字RT-PCR扩增方法每个样品微滴式数字RT-PCR扩增设置3个平行。微滴式数字RT-PCR扩增体系配制如表1。该步骤按照不同微滴式数字PCR平台的说明书进行操作。表1微滴式数字RT-PCR扩增体系试剂终浓度体积a2×酶混合液/10μLFlu-A-F（10μmol/L）0.5μmol/L1μLFlu-A-R（10μmol/L）0.5μmol/L1μLFlu-A-P（10μmol/L）0.1μmol/L0.2μLRNA模板/2μL无核酸酶水/5.8μL总体系/20μL注：使用微滴式数字PCR平台进行实验时，应依据不同微滴式数字PCR平台依据调整扩增体系的组分

6、和最终体积，表中所列组分的终浓度不变。a微滴式数字RT-PCR扩增试剂。反应液配制后，使用微滴发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成后，进行微滴式数字RT-PCR扩增。荧光分析步骤采用FAM单荧光通道，微滴式数字RT-PCR扩增程序如表2所示。2T/CVMA8—2018表2微滴式数字RT-PCR扩增程序步骤温度持续时间循环数142℃60min1295℃10min1395℃30s40455℃1min598℃10min164℃60min1注：升降温速率设置为2.5℃/s。6.4微滴式数字RT-PCR反应的对照在进行微滴式数字RT-PCR实验时，应设置阳性对照、阴性对照与空白对照。以提取的动物A

7、型流感病毒RNA溶液作为阳性对照；以提取的A型流感病毒阴性动物组织悬液核酸作为阴性对照；以无核酸酶水作为空白对照。各对照RT-PCR扩增体系中，除模板外，其余组分和RT-PCR扩增程序同6.3。7结果分析7.1实验成立条件微滴式数字RT-PCR扩增结果，有效微滴数不得低于理论微滴数的60%。阴性对照组和空白对照组均未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴，且核酸拷贝数浓度≥10copies/μL，则实验成立。7.2阈值设定