原代细胞培养实验---小鼠胚胎成纤维细胞培养.ppt

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1、原代细胞培养实验---小鼠胚胎成纤维细胞培养指导教师：费晓方2014年6月掌握无菌操作技术。掌握组织细胞的消化与分散。熟悉原代细胞培养的一般方法与步骤。熟悉小鼠解剖操作技术。实验目的和要求：选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，胚胎成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。每组小鼠胚胎2-5个动物的选择：实验材料：每组的超净台中有以下物品：1.50ml配制好的RPMI1640（或DMEM）培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-)(生理型磷

2、酸盐缓冲液)1瓶2.100ml灭菌烧杯2个；3、50ml离心筒2个4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个4、1ml，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个5、细胞计数板1块；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；7、酒精灯1台；试验操作步骤：1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)a．采用认可的方案处死啮齿动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿

3、上。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS(-)的100ml烧杯中。f．漂洗胚胎，去掉PBS(-)。继续用PBS(-)漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。2)将2－5个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用PBS漂洗。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离心筒中,加入40ml0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动。4)在温暖的环境中或置于37°C培养箱中轻轻摇动15分钟。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该

4、管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。试验操作步骤：7)离心混合的细胞悬液，1200r／rain，5分钟，弃上清。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。10)用含有10％牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM(GIBCO／BRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降

5、。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。试验操作步骤：12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml1％醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。13)按每细胞瓶Ix106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37°CC02培养箱中孵育直至细胞铺满。14)隔天进行细胞观察。试验操作步骤：