生物化学检验常用分析技术课件.ppt

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1、第一节光谱分析技术光谱分析（分光光度技术）：利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。特点：灵敏、快速、简便。是生物化学分析中最常用的分析技术。光谱分析技术分类一、吸收光谱分析法吸光度与透光度光照射到物质可发生折射、反射和透射,一部分光会被物质吸收，一部分光被溶液透过，另一部分光被散射。设入射光强度为I0，透射光强度为I，透射光强度与入射光强度的比值称为透光度，也叫透射率，以T表示。在光谱分析中，常常用吸光度表示溶液对入射光的吸收程度。吸光度与透光度的关系是：吸光度等于透光度的负对数，用A表示吸光度，

2、有下列公式关系。该公式表明，当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度及溶液浓度的乘积成正比。此即朗伯-比尔定律。在朗伯-比尔定律中，比例常数k称为吸光系数。如果溶液浓度以物质的量的浓度表示时，此常数称为摩尔吸光系数（ε），它表示在一定波长下测得的液层厚度为1cm、溶液浓度c为1mol/L时的溶液吸光度值。如果溶液浓度以质量体积比表示时，此常数称为比吸光系数（），它表示当溶液浓度为1g/L、液层厚度为1cm时，在一定波长下测得的吸光度值。摩尔吸光系数ε和比吸光系数可相互换算。、Lambert-Beer定律的应用条件：Lambert-Beer定律适用可见光、紫

3、外光和红外光；适用均匀非散射的液态样品，固体气态等Lambert-Beer定律要求条件1、入射光必须是单色光2、被测样品必须是均匀介质3、吸收过程中，吸收物质之间不发生相互作用4、Lambert-Beer定律的偏离现象1.吸收定律本身的局限性L-B定律是一个有限的定律，只有在稀溶液中才能成立。2、仪器因素(非单色光的影响)3、化学因素溶液中的溶质可因c的改变而有离解、缔合、配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离L-B定律的现象。例:在水溶液中，Cr(Ⅵ)的两种离子存在如下平衡Cr2O42-+H2O⇌2CrO42-+2H+Cr2O42-、CrO42-有不同的A值，溶

4、液的A值是二种离子的A之和。但由于随着浓度的改变(稀释)或改变溶液的pH值，[Cr2O42-]/[CrO42-]会发生变化，使C总与A总的关系偏离直线。4.其它光学因素(1)散射和反射:浑浊溶液由于散射光和反射光而偏离L-B(2)非平行光紫外-可见分光光度法的原理物质对光的选择吸收当一束光照射到某种物质的固态物或溶液上时，一部分光会被吸收或被反射，不同的物质对于照射它们的光束的吸收程度是不同的，对某个波长的光吸收强烈，对另外波长的光吸收很小或不吸收，我们把这种现象称为光的选择吸收。一切物质都会对可见和不可见光中的某些波长的光进行吸收。物质呈现各种各样颜色，就是它

5、们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的结果。待测管2待测管1标准管试剂空白管物质颜色和吸收光颜色的关系吸收光物质颜色颜色波长(nm)黄绿紫400~450黄蓝450~480橙绿蓝480~490红蓝绿490~500紫红绿500~560紫黄绿560~580蓝黄580~600绿蓝绿600~650蓝绿红650~750物质的结构决定了物质在吸收光时只能吸收某些特定波长的光。我们可以利用测量物质对某种波长的光的吸收来了解物质的结构特性。用经过分光后的不同波长的光依次透过该物质，通过测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，就可以得到该物

6、质在测量波长范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力，称为吸收光谱。紫外-可见分光光度法的原理入射光透射光不同波长光检测器吸收光谱紫外-可见分光光度法的原理紫外-可见分光光度法是利用物质对光的吸收光谱，对物质进行定性分析或定量分析的方法。按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。0.01nm0.1nm800nm10µm500µm1cm波长200nm400nm2.5µm25µm1m光谱可区域见γ射线χ射线紫外光光红外光微波无线电波分析分光方法χ射线紫外分光度核磁共振γ射线光谱法光谱法光光度法

7、法红外光谱法微波光谱法光谱法紫外-可见分光光度法的原理-定量分析波长范围吸光度最大吸收波长利用标准曲线法定量分析在一定波长（λmax）下测定某物质的标准系列溶液的吸光度作标准曲线，然后测定样品溶液的吸光度值，由标准曲线求得样品溶液的浓度或含量。01.02.03.04.0c(mg/mL)。。。。0.800.600.400.200.00Axcx（二）原子吸收分光光度法　　原子吸收分光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。即在一定条件下，原子的吸光度同原子蒸气中待测元素基态原子的浓度成正比。　　常用的定

8、量方法有：