实验十三 碱变性法小量制备质粒DNA.ppt

《实验十三 碱变性法小量制备质粒DNA.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、分子生物学实验实验目录碱裂解法小量制备质粒DNA2.感受态细胞制备3.质粒转化4.聚合酶链式反应（PCR）实验一碱变性法小量制备质粒DNA一、实验目的掌握碱裂解法提取质粒的方法二、实验原理分离质粒DNA方法碱变性法煮沸法SDS法羟基磷灰石层析法等各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化碱变性法基本原理在pH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DN

2、A之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA三、实验材料实验试剂ＬＢ培养基：胰化蛋白胨10g酵母提取物5g定容1000mlpH7.5NaCl10gＳＴＥ：0.1MNaCl10mMTrisHCl(pH8.0)1mMEDTAＡｍＰ50mg/ml溶菌酶10mg/ml(用10mMTris·HClpH8.0新鲜配制）溶液Ⅰ：50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDT

3、A溶液Ⅱ：（新鲜配制）0.2NNaOH1%SDS溶液Ⅲ：5MKAC10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml酚，氯仿，乙醇RNase琼脂糖ＴＥ：10mMTris-HCl(pH8.0)1mMEDTA四、实验方法１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5mlLB培养液中（含AmP50μg/ml），３７℃强烈摇荡过度２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１mlSTE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟四、实验方法４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻

4、柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟６．12000g4℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g4℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。９．12000g,4℃离心５分钟。10．弃上清，加入１ml70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g4℃离心２分钟。11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。12．加入50μlTE（含20μg/mlRNA酶，不含DNA酶）

5、溶解DNA。13．取10μlDNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD280之比14.同时以以下公式计算得率质粒DNA得率：稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml15．取10μlDNA溶解液加2μlLoadingbuffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果五、实验结果分析１．根据质粒DNAOD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度２．记录电泳结果并说明结果内容六、思考题１．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中分别加入上述溶液后

6、，反应体系出现的现象及其成因２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因实验二大肠杆菌感受态细胞制备实验目的学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法实验原理感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态细菌经低渗氯化钙处理后，细胞膨胀、细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞的状态本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态实验仪器超净工作台台式高速冷冻离心机恒温空气摇床实验试剂大肠杆菌DH5αLB培养基，0.1mol/LCaCl2溶液（预冷）实验步骤菌株活化感受态细胞制备实验步骤菌株活化1

7、．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4感受态细胞制备4．将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置15－30min5．6000rpm离心10min,弃上清6．加入0.3ml预冷的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min7．4000rpm离心5min,弃上清8．加入0.2ml预冷含有甘油的0.1mol/lCaCl2,悬浮沉淀，即为感受态细胞，

8、可－70℃长期保存思考题1.常用制备感受态细胞的大肠杆菌有哪些2.