碱变性法提取质粒

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1、质粒DNA小量提取试剂盒一、产品简介采用SDS碱裂解法，结合硅胶膜选择性吸附DNA的方法，适合1-4ml细菌培养物中提取多至20μg质粒DNA。纯化的质粒DNA适合用于酶切、PCR、测序、转化和转染等分子生物学实验。二、试剂盒组成和储存组成内容DBI-2011(50次)DBI-2012(200次)RNaseA1＊30μl120μlBufferBL15ml60mlBufferP115ml60mlBufferP215ml60mlBufferP320ml90mlBufferWA§19ml75mlBufferWB§16ml65mlDNA吸附柱-B50套200套1.5ml离心管5

2、0个200个TE※15ml30ml说明书1份1份＊RNaseA1:50mg/ml,-20℃长期保存；第一次使用前将RNaseA1全部加入BufferP1中，于4℃保存。§BufferWA和BufferWB，使用前按试剂瓶所示体积加入无水乙醇或者95%乙醇，混合均匀。※TE：10mMTris-HCl,0.1mMEDTA,pH8.0(25°C)。除RNaseA1和BufferP1(已加入RNaseA1)外，其他组成成分于室温储存。三、注意事项1.BufferP3和BufferWA含刺激性化合物，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛，立即使用大量水或生理盐

3、水冲洗沾染处，必要时寻求医疗咨询。2.使用后应及时盖紧试剂瓶盖子，以免影响下次使用效果。3.操作步骤A2和B2，充分悬浮细菌，无可见的块状菌团，不然会影响裂解效果。4.操作步骤A3和B3，缓慢翻转离心管，以免机械力打断基因组DNA而导致最后纯化的质粒DNA中有基因组DNA污染，同时避免打断质粒DNA，保持其完整性。5.操作步骤A3和B3，溶液呈透亮后，需立即加入BufferP3，避免质粒DNA长时间暴露于BufferP2（含NaOH，强碱性环境）中完全变性为单链DNA后无法复性恢复为超螺旋状态。6.操作步骤A4和B4，形成紧实的大团状凝集物前需缓慢摇晃离心管，避免机械力

4、打断基因组DNA和质粒DNA；之后快速剧烈摇晃3次将凝集物打散，有助于充分释放质粒DNA，从而提高产量。7.操作步骤5，室温放置1-2min，有助于提高DNA吸附效率，从而提高产量。8.操作步骤10，室温放置1-2min，有助于提高DNA洗脱效率，从而提高产量。四、操作步骤平衡DNA吸附柱(此步骤可提高硅胶介质吸附DNA效率，可在使用本试剂盒当天任何时间操作)在DNA吸附柱-B（置于2ml离心管中）中加250μlBufferBL，室温12,000×g离心1min，弃废液，将DNA吸附柱-B放回2ml离心管中。根据菌量选择方法A或者B提取质粒DNA从≤2×109细菌中提取

5、质粒DNA，请选择方法A.从少量细菌中提取质粒DNA。从2×109-4×109细菌中提取质粒DNA，请选择方法B.从常规数量细菌中提取质粒DNA；▲培养至OD600为1-1.5，此时1ml菌液中约含1.0×109细胞。从1-2ml菌液中提取质粒DNA按照方法A操作，从2-4ml菌液中提取质粒DNA按照方法B操作。▲如果细菌生长状态不佳，视离心收集后细菌沉淀体积选择提取质粒DNA的方法。估算细菌沉淀体积，细菌沉淀体积≤30μl按照方法A操作，细菌沉淀体积≥30μl按照方法B操作。▲方法A可以减弱BufferP2（含NaOH，强碱性环境）对质粒DNA的变性作用，减少质粒DN

6、A完全变性为单链DNA后无法复性恢复为超螺旋状态的比例。A.从少量细菌中提取质粒DNA实验准备：第一次使用前，将试剂盒携带的RNaseA1全部加入BufferP1中。检查BufferP2是否析出白色沉淀，如有沉淀在37℃放置数分钟，沉淀溶解后恢复至室温使用。A1.用干净的1.5ml离心管，室温12,000×g离心1min收集≤2×109细菌；弃尽上清。A2.加入100μlBufferP1（含RNaseA1），Vortex震荡或者用Tips充分悬浮细菌。A3.加入100μlBufferP2，缓慢翻转离心管混合均匀，直至溶液呈浅黄色透亮状。A4.立即加入140μlBuffe

7、rP3，缓慢翻转离心管混合均匀，形成紧实的大团状凝集物后（约摇晃15次），快速剧烈摇晃3次使凝集物呈松散状；室温12,000×g离心5min。▲如果离心上清中有漂浮的凝集块，快速摇晃3次后再次离心。继续操作步骤5.B.从常规数量细菌中提取质粒DNA实验准备：第一次使用前，将试剂盒携带的RNaseA1全部加入BufferP1中。检查BufferP2是否析出白色沉淀，如有沉淀在37℃放置数分钟，沉淀溶解后恢复至室温使用。B1.用干净的1.5ml离心管，室温12,000×g离心1min收集2×109-4×109细菌；弃尽上清。B2.加入250μ