基因沉默原理.pdf

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1、目录RNAi及基因沉默原理百奥迈科（Biomics）RNAi产品与服务一览1.siRNA生物合成1.1全位点siRNA表达文库构建服务1.2RNAi载体构建技术服务TM1.3GeneTargetsiRNASet2.siRNA化学合成2.1化学合成siRNA简介2.2siRNA设计2.3百奥迈科(Biomics)siRNA产品简介2.4普通siRNAoligo2.5荧光标记siRNAoligo2.6化学修饰siRNAoligo2.7miRNA的化学合成2.8RNAi系列优惠套餐2.9siRNA对照3.RNAi病

2、毒包装3.1腺病毒载体包装3.2慢病毒载体包装3.3其他类型病毒载体包装4.哺乳动物细胞siRNA转染4.1转染方法4.2转染步骤4.3转染优化及注意事项5.mRNA水平检测基因沉默5.1mRNA的提取/制备5.2.实时定量荧光PCR6蛋白质水平检测基因沉默6.1Westernblot6.2ELISA6.3免疫荧光7.其他相关服务7.1稳定细胞筛选服务7.2细胞增殖毒性检测服务7.3细胞凋亡检测服务7.4DNA测序8.RNAi相关产品TM8.1RISORNA抽提试剂8.2其他‐ 1 ‐ RNAi及基因沉默原理

3、RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21-25nt及3'端突出的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并

4、将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。‐ 2 ‐ 百奥迈科（Biomics）RNAi产品与服务一览‐ 3 ‐ 1.siRNA生物合成1.1全位点siRNA表达文库构建服务本公司拥有自主知识产权的全位点siRNA文库构建技术，能够从全长cDNA构建包含所有有效结合位点，长度分布于19-23bp的靶基因的siRNA分子库，亦可以模仿体内Dicer酶切割长度为21-23bp的分子库，适用于高通量功能基因及相关药物靶点筛选。1.1.1构建流程：1）客户可选：ò提供靶基因的cD

5、NA克隆。ò提供靶基因的相关信息(基因的mRNA序列或GenbankAccessionNumber)。ò也可在本公司的cDNA产品目录中，挑选靶基因cDNA克隆。2）进行siRNA文库构建，抽样测序验证。3）根据客户要求提供相应的文库产品。4）将其连同抽样报告、产品说明书一起寄送到客户手中。A.HBVPolymeraseDomainsiRNA表达文库位点分布（随机抽样测序）PolymeraseDomain(984bp):B.构建的Survivin基因全位点siRNA表达文库，文库抽样基因沉默(qPCR)筛选结

6、果：该数据显示，本公司siRNA文库位点分布的随机性，可以更好地找到最优的靶点。s1-s8:RandomlyselectedsiRNAsequencesfromBiomicslibrarys9/s10/s11:ThepublishedsiRNAsequencestarget-off:Negativecontrolun-transfect:Untreatednormalcontrol‐ 4 ‐ 1.2RNAi载体构建技术服务1.2.1技术特点：1）多种siRNA表达载体，可以在细胞内直接转录出siRNA，行使其

7、RNAi功能，包括：òU6启动子表达载体；òH1启动子表达载体；òU6、H1双启动子表达载体；òCMV启动子表达载体；2）载体带有GFP标签可以监测转染效率。构建好的siRNA表达载体可直接用于转染细胞进行RNAi实验;3）本公司还可根据客户需要提供各种商业化表达载体;4）本公司可以为客户构建线性siRNA表达载体，shRNA表达载体，miRNA表达载体以及病毒型RNAi载体。1.2.2构建流程：1）siRNA靶点设计；ò客户提供靶基因的siRNA序列，由本公司将其克隆到siRNA表达载体上。ò客户提供靶基因

8、的相关信息（基因的mRNA序列或GenbankAccessionNo.），根据客户要求，本公司设计高效特异性的3-4条针对靶基因的siRNA。2）合成设计好的DNA并退火形成双链DNA，克隆到客户要求的载体上。3）通过测序进行验证。4）构建成功的siRNA质粒连同测序报告、产品说明书一起寄送到客户手中。注：可根据客户要求提供siRNA的阳性及阴性对照质粒。1.2.3质量保证：符合设计要求的siRNA