小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离word版本.docx

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1、小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离精品文档小鼠尾静脉取血所需器材：热光源（如：普通台灯），鼠尾固定器，刀片，1.5mlEP管。步骤：1.烘烤。用热源烘烤小鼠使其血管膨胀。烤至小鼠开始有剧烈反应时，关掉热源。2.割尾。烤完后将小鼠固定将尾部露在外面，用刀片割一下鼠尾远心端腹侧静脉血管使血液流出，立即用1.5mlEP收集滴下来的血液。3.止血。用干棉球按压伤口或按压尾部近心端止血，以防失血过多死亡。要点1.烤：烤的不够：血管未膨胀，割尾后血液不易流出。烤的太过：小鼠死亡。2.割：割的太浅：血液不流出。割的太深：鼠尾被割断。后续应用：收集于网络

2、，如有侵权请联系管理员删除精品文档取血时可根据需要选择是否需加抗凝剂。所取血可用于血液学指标的检测，如EPO浓度、甘油三酯浓度、红细胞数及红细胞压积等。附表：本实验室常用的2种取血方法的比较尾静脉取血VS眼眶后静脉丛取血尾静脉取血眼眶取血取血量（小鼠）200-300ul200-300ul多次取血可以可以简便易学是否动物损伤小大，损伤脑神经操作时间慢快小鼠脾淋巴细胞分离收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档所需器材（以下均为取1只鼠脾需准备的量）：手术器械——剪刀、镊子至少2套（高压灭菌），止血钳一个（高压灭菌），细头玻璃吸管一根

3、（高压灭菌），，200目尼龙网一张（高压灭菌），一次性5ml注射器一支，15ml和50ml离心管各一个，60mm中皿及血球计数板一块。所需试剂：小鼠淋巴细胞分离液，无血清1640，进口血清，青链霉素（双抗）（100X），NEAA，丙酮酸钠，谷氨酰胺，β-巯基乙醇注：200目尼龙网和小鼠淋巴细胞分离液均从达科为公司购买。分离原理示意图收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档图一小鼠脾脏研磨示意图图二离心后小鼠脾细胞分层示意图分离步骤及要点：1.断颈处死小鼠，75%乙醇中浸泡几分钟消毒。2.将小鼠转移至超净台中，先用一套剪刀和镊子剪开

4、小鼠皮肤使腹腔内脾脏可见。换一套干净的剪刀和镊子剪开腹腔，小心用镊子夹出脾脏，用剪刀尽量去除附着其上的脂肪组织。脾脏位于小鼠左侧腹部，为一暗红色长条形器官，不要误取肾和肝。取出后浸泡于RPMI1640中稍作清洗。注意无菌操作。3.在一无菌的中皿中加入5ml淋巴细胞分离液，用止血钳将尼龙膜固定在中皿上，放上脾脏开始研磨（如图一所示）。注意利用尼龙膜的弹性研磨。研磨时间不要超过5分钟，否则淋巴细胞分离液挥发导致其密度发生改变，影响分离效果。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档1.将上述中皿中的淋巴细胞分离液转移至15ml离心管，沿

5、管壁小心加入约200ul的无血清RPMI1640，立即旋紧管盖，800g室温离心30分钟。注意室温离心！加速度如有10档，设为第3档。2.离心后细胞分层如上图二所示。用细头玻璃吸管将淋巴细胞层吸出至50ml离心管中，加入10倍体积无血清1640培养基，混匀后250g室温离心10分钟。3.小心弃去上清，用1ml淋巴细胞培养基重悬细胞计数，稀释200倍计数。一般能取到0.5-1*108个/脾。按适当密度种至培养皿中，37度，5%CO2培养。注意全程无菌操作！注：此处所分离细胞为单个核细胞（PBMC），为细胞混合物，其中主要是淋巴细胞，淋巴

6、细胞中又以B淋巴细胞为主。后续试验：分离到的淋巴细胞可继续用磁珠分选纯的B细胞、T细胞做相应检测（提基因组，提蛋白检测某基因表达等），在本人实验中分选到的淋巴细胞使用LPS刺激后只有B淋巴细胞增殖，之后使用逆转录病毒感染，将感染的B淋巴细胞作为基因治疗的靶细胞。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除