行业标准:GBT 27637-2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41羁雪中华人民共和国国家标准GB/T27637--2011副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法Real—timePCRmethodforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.p口r口‘H6ercHZosis2011-12-30发布2012-04—01实施宰瞀鹊紫瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪19刖昌GB/T27637--2011本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口。本标准起草单位:中华

2、人民共和国广东出入境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有限公司。本标准主要起草人:刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中、吴晓薇、高小博。1范围副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27837--2011本标准规定了副结核分枝杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis)实时荧光PCR检测方法的技术要求和操作规范。本标准适用于快速检测培养物、血样、奶样、粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,

3、仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682--2008分析实验室用水规格和试验方法GB194892008实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。ct值:荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸。DMSO:dimethylsulfoxide,二甲基亚砜。EDTA:ethylenediaminetetraaeeticacid,乙二胺四乙酸。PBS:phospha

4、tebuffersolution,磷酸盐缓冲液。PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。Taq酶:TaqDNA聚合酶。UDG酶:uracilDNAglycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶。4原理本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理。反应体系中包括一对用于扩增DNA的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针。探针的5’端标记了被称为报告基团的荧光素,3’端标记了淬灭基团。在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5’外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来,使其与淬灭基团分离

5、,从而仪器能检测到5’端荧光基团所发出的荧光信号,一分子PCR扩增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生。随着扩增循环次数的增加,仪器检测到的荧光信号的累积反应了扩增产物量的变化。本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板,设计特异扩增引物和探针建立荧光PcR反应体系。5材料与试剂5.1仪器与耗材5.1.1接种棒。GB/T27637--20115.1.2无菌注射器或真空采血管。5.1.3灭菌容器。5.1.4橡胶管。5.1.5刮匙。5.1.6荧光PCR仪。5.1.7恒温水浴锅(室温至100℃)。5.1.8离心机(最高离心力达

6、15000×g以上)。5.1.9混匀器。5.1.10冰箱(2℃~8℃,--20℃,一80℃)。5.1.11天平(精密度达千分之一以上)。5.1.12微量可调移液器(i0pL,100pL,1000pL)。5.1.13微量带滤芯吸嘴(10pL,100pL,1000pL)。5.1.14研钵。5.1.15离心管。5.1.16PcR光学反应管。5.2试剂5.2.1试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682--2008规定的二级水,所用化学试剂均为分析纯。5.2.2引物与探针:采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制

7、成100pmol/L储存液,置~20℃或更低温度冻存;使用时取适量配制成10pmol/L工作液,避免多次冻融。上游引物:5'GTCAGCGGCGGTCCAG3’,下游引物:5’GcAGCTCCAGATCGTCATTc3’,探针:5LFAM—ACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC3’BHQ-1。5.2.30.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。5.2.4柠檬酸钠缓冲液:配方见A.2。5.2.50.5mol/LEDTA:配方见A.3。5.2.6柠檬酸钠一磷酸缓冲液:配方见A.4。5.2.74%氢氧化钠溶液:配方见

8、A.5。5.2.84%硫酸溶液:酉已方见A.6。5.2.9TritonX一100。5.2.10DNA提取液:含100mmol/LTris-HCl(pH8.o),0.01%TritonX一100,200pg几L蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5.2.11灭菌双蒸

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