实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究-论文.pdf

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1、·24O·中国国境卫生检疫杂志2014年8月第37卷第4期ChineseFrontierHealth——·实验研究与疾病监测·实时荧光PCR方法检测结核分枝杆菌mRNA的研究董瑞玲，朱玉兰，张淑平，古莉冰2王佃鹏3杨俊，孙杰，刘胜牙1．~11国际旅行卫生保健中心，广东深圳518033；2．深圳出入境检验检疫局；3．深圳市职业病防治院摘要：目的建立检测结核分枝杆菌mRNA表达水平的实时荧光PCR反应体系，快速鉴定结核分枝杆菌。方法设计合成结核分枝杆菌mRNA相应引物和探针，探针标记以JOE为报告基团，BHQ1为猝灭基团。优化反应条件，建立结核分枝杆菌mRNA的实时荧光PCR检测

2、方法。通过检测22份肺结核患者痰液、10份健康无症状人群痰液、结核分枝杆菌标准菌株和偶然分枝杆菌菌株培养菌落，检验方法的特异性、重复性和灵敏度。结果肺结核患者痰液检测均出现典型扩增曲线，CT均值31．35，标准差4．31。健康无症状人群痰液及偶然分枝杆菌未出现扩展曲线。对痰液标本及稀释RNA重复检测的变异系数在2．54％以下，检测CT值与痰涂片抗酸染色分枝杆菌的数量呈良好相关性。结论建立了一种快速实时检测结核分枝杆菌mRNA基因的荧光PCR方法，具有良好的敏感性和特异性。关键词：结核分枝杆菌；mRNA；实时荧光PCR中图分类号：R34文献标识码：BDetectionmetho

3、dofsputumMycobacteriumtuberculosismessengerRNAwithreal-timePCRDONGRui-ling，ZHUYu-lan，ZHANGShu-ping，GULi-bing，WANGDian-peng，YANGJun，SUNJie，LIUSheng-yaShenzhenInternationalTravelHeahhcareCenter，Shenzhen，Cuangdong518033，ChinaAbstract：ObjectiveToestablishareal-timeRT-PCRmethodforquicklyidentify

4、ingMycobacteriumtuberculosismessengerRNA(mRNA)．MethodsMycobacteriumtuberculosismRNAprimersandprobeweredesigned，andprobewaslabelledbyJOE—BHQ1．Atotalof22samplesofTBpatients’sputum，10samplesofhealthysymptomlesspeoples’sputum，M．tuberculosisATCC27294。M．fortuitumATCC6841weretestedtoevaluatethespe

5、cificity，reproducibilityandsensitivityofthemethod．ResultsAllTBpatients’sputumweretestedpositiveforTBmRNAbyreal—timePCRmethodwithCTaverageva]ue31．35(SD4．31)．M．tuberculosisATCC27294wasalsopositive，while10healthysymptomlesspeoples’sputumandfortuitumATCC6841werenegative．TBmRNAreproductivitytest

6、ingshowedCT’Scvwereabout2．54％．ConclusionThisreal—timePCRmethodcoulddetectTBmRNAwithappropriatesensitivityandspecificity．Keywords：Mycobacteriumtuberculosis；mRNA；Real—timePCR结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染PPD试验由于结果易受患者免疫状态和既往接种卡病，2010年新修订的《中华人民共和国国境卫生检介苗的影响。亦不能区分潜伏感染和结核病，在结疫法实施细则》中，明确规定卫生检疫机关应当阻止核诊断的应用中尚

7、存在很大的局限性。因此，灵敏患有传染性肺结核病的外国人人境【1]。而准确检测度高，特异性强、检测时间短的PCR检测技术在防到具有传染性的结核分枝杆菌活菌是国境口岸拦截控结核工作中起着越来越重要的作用。针对结核分传染性肺结核的关键。目前实验室检测结核杆菌的枝杆菌DNA和16SrRNA进行检测的PCR方法不常用方法是痰涂片检查、分枝杆菌培养和结核菌素能判断细菌在体内的活性，往往出现PCR扩增阳性试验(PPD)闭。痰涂片检查受痰标本采集质量和患者而培养阴性的情况圈。结核分枝杆菌信使RNA(mRNA)，感染特性