工程菌发酵生产氨基酸氮源选择和过程调控.ppt

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1、工程菌发酵生产氨基酸的氮源选择与过程调控陈宁天津科技大学代谢控制发酵技术国家工程实验室基因工程菌的发酵工程菌的来源1工程菌的应用2工程菌的培养3氨基酸发酵的氮源选择4一、工程菌的来源基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代基因工程基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限

2、制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术、基因的突变技术、基因的导入技术等基因工程一、工程菌的来源表达载体基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目的)DNA而将目的DNA带入宿主细胞，常用的载体有质粒、噬菌体、病毒外源基因插入载体中，使其处于一系列的表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载

3、体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体一、工程菌的来源质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。质粒上常有抗生素的抗性基因一、工程菌的来源目的基因的获得载体的选择与制备目的基因与载体连接成重组体转化或转染受体细胞重组菌的筛选及目的基因的表达构建步骤一、工程菌的来源构建步骤一、工程菌的来源苏氨酸基因工程菌构建策略二、工程菌的应用就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程

4、菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点三、工程菌的培养基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长速率及表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA的稳定性尤为重要基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细胞培养过程，由于回复突变或分配作用致使DNA丢失，称为脱落性不稳定，其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变，不再表达目的产物，称为结构性不稳

5、定培养特点三、工程菌的培养质粒稳定性三、工程菌的培养在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化质粒稳定性三、工程菌的培养使质粒稳定的措施

6、组建合适载体选择适当宿主施加选择压力抗生素添加法抗生素依赖变异法营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件（温度、pH、DO）控制培养条件三、工程菌的培养培养基组成：不同的培养基能影响微生物的代谢活动，也能影响质粒的稳定性。质粒在丰富培养基中比在最低限量培养基中更加不稳定培养温度：含有重组质粒的克隆菌的比生长速率往往比受体菌要小，同样质粒导入受体菌后会使受体菌的生长温度改变。通常而言，低温有利于重组质粒稳定地遗传控制培养条件三、工程菌的培养溶氧：携带质粒的基因工程菌相对于野生菌增加了额外的代谢负担，对氧需求量较大，发酵液中必须有足够浓度的溶解

7、氧，才能满足菌体生长及产物合成的需要过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，菌体生长受到抑制，质粒稳定性差控制培养条件三、工程菌的培养菌体比生长速率：比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。有时，比生长速率大有利于重组质粒稳定地遗传如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长快，则重组质粒的丢失就不会导致非常严重的后果。因此调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性，但这点往往难以达到，因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的比生长速率在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速

8、率，来提高重组质粒的稳定性。如在重组质粒中克隆入抗高浓度抑制的某个基因，这样在进行高浓度底物培养时，受体菌被抑制，比生长速率下降，而重组菌仍能正常生长三、工程菌的培养在基因工程细